22. Bad基因编码204个氨基酸,是Bel2(B细胞淋巴瘤/白血病-2)家族中相关的促凋亡基因。下图为科研人员获得Bad基因重组细菌的主要流程。请回答:
(1)构建Bad基因的克隆时,基因组DNA不能直接用作PCR扩增的模板,原因是真核生物基因组中存在
_________序列,在形成mRNA的剪接加工过程中被切除。从细胞中提取总RNA或mRNA,在
__________的引导下使用逆转录酶来合成cDNA链。
(2)引物设计的质量是决定图中“②PCR”成败的关键因素。首先从核酸数据库中获得mBad基因的编码序列,然后在引物的
_________端加上不同的限制酶切位点序列,第三步为了保证抗原标签与mBad基因表达产物中氨基酸顺序正确,有时需要补加核苷酸,但是注意不能产生
_____________,否则会导致蛋End白质分子量的减小。
(3)如图为②PCR过程的程序参数。②过程PCR反应体系配制完成后,先在冰上预冷,等程序设置完毕后再放入PCR仪中,这种冷启动法可以
_________。Step1和Step8的主要目的分别是
_________。由于Step3引物含有
___________,不能和模板完全匹配,所以Step3的温度比Step6要低一点。
(4)一般而言,②过程中双链DNA分子越大则电泳迁移速率越
____________。除此之外,DNA分子的构型对其电泳迁移速率影响也大:环状超螺旋DNA电泳的速率一般快于线形DNA。从结构的角度分析,原因可能是
______________。
(5)研究人员在④过程中应优先选择
___________和
_____________两种限制酶及E.colDNA连接酶形成重组质粒。
(6)筛选得到的阳性重组子细菌还需要进一步通过DNA测序,原因是
____________。