【推荐1】三氯生是一种抑菌物质，具有优异的贮存稳定性，可以替代抗生素用于基因工程中筛选含目的基因的受体细胞。已知fabV（从霍乱弧菌中发现的烯脂酰ACP还原酶）基因可以使大肠杆菌抵抗三氯生。

(1)通过PCR方法扩增fabV基因时，先要根据_____设计两种特异性引物序列，以确保Taq酶从引物的3′端延伸DNA链，至少需要经过_____次扩增才能获得8个双链等长的目的基因。
(2)基因工程的核心步骤是_____；某科研团队将可以受温度调控的基因插入上述选出的重组质粒中，构建了温度调控表达质粒（如图2）。其中C基因在低温下会抑制P₂，R基因在高温下会抑制P_1，如果将lacZ基因和GFP（绿色荧蛋白）基因插入图2质粒中，使得最后表现为低温下只表达GFP蛋白，而高温下只表达lacZ蛋白。则lacZ基因插在_____之间，GFP基因的插入位置及注意点是_____。
(3)若以大肠杆菌为受体细胞，筛选上述插入了GFP基因的受体细胞的依据是：大肠杆菌能在含_____的培养基上生长，且_____。

【推荐1】某转基因牛的生产技术流程如图。请回答：

（1）利用过程①的方法构建的基因文库是____________________（填“基因组文库”或“部分基因文库”）；PCR技术大量扩增此目的基因的前提是__________________________，以便合成引物；PCR扩增过程经过变性、复性和__________三个步骤。        
（2）转入生长激素基因的牛可通过乳腺细胞分泌乳汁来生产人生长激素，过程②中，将目的基因与_________的启动子等调控组件重组在一起构建重组质粒，通过________法导入受精卵中，然后利用胚胎工程的______________________________ (答出2项)技术手段获得转基因牛。
（3）该转基因牛进入泌乳期后，其分泌的乳汁中并未含有人的生长激素，可能的原因是_________________________。

【推荐3】红景天中的HMA3基因能编码Cd转运蛋白。科研人员将红景天中的HMA3基因转入栾树，以实现栾树的定向改良，使其增强对Cd的富集能力，从而更有效治理Cd污染。实验的主要流程如图，其中Hyg^r为潮霉素抗性基因，Kan^r为卡拉霉素抗性基因。下表为限制酶的识别序列和切割位点。请回答下列问题。
   

EcoR I	BamH I	Hind Ⅲ	Sau 3AI	Bg/ II	Xba Ⅰ
G↓AATTC	G↓GATCC	A↓AGCTT	↓GATC	A↓GATCT	T↓CTAGA

(1)重组质粒的构建、扩增、保存：
①从红景天细胞中提取总RNA为模板，进行RT-PCR，该过程需要加入的酶有_________。PCR过程中在循环前常要进行一次94℃、5min预变性，其目的是________。
②据以上图表分析，为构建Cd转运蛋白与绿色荧光蛋白（GFP）的融合蛋白，进行PCR扩增HMA3基因时需要在引物的5’端添加限制酶________的识别序列，以确保目的基因与质粒正确连接。至少需要________个循环才能获得预期的基因。若模板HMA3基因的数量为a个，进行35个循环后，产物中同时含有两种引物的DNA有________个。
③通过DNA连接酶进行连接制备重组质粒，并依次转入大肠杆菌和农杆菌。其中将重组质粒转入大肠杆菌的主要目的是________
(2)栾树愈伤组织的诱导：
切割无菌苗将其茎段插入愈伤组织培养基，培养基应添加________（填植物激素的名称），放入培养箱，经过21d的黑暗诱导，形成愈伤组织。
(3)农杆菌介导转化体系的建立：
将农杆菌单克隆菌株对栾树愈伤组织进行侵染转化，并用添加________的培养基筛选出转化成功的愈伤组织，将愈伤组织继续培养成完整植株。
(4)原生质体制备及目的基因的检测和鉴定：
①取4g筛选后愈伤组织，用镊子轻轻捣碎，冲洗。用滤网过滤溶液，将愈伤组织转移至含_________的酶解液中处理一段时间获得原生质体。
②在激光共聚焦下观测到细胞膜发出绿色荧光。在本研究中选择GFP与Cd转运蛋白构建融合蛋白的目的是________。科学家们已通过蛋白质工程技术制造出了蓝色荧光蛋白，正确的顺序是________（用下列序号表示）。
①推测蓝色荧光蛋白的氨基酸序列和基因的核苷酸序列
②蓝色荧光蛋白的功能分析和结构设计
③蓝色荧光蛋白基因的修饰（合成）
④表达出蓝色荧光蛋白

【推荐1】下图为“乙肝基因工程疫苗”生产过程图解，质粒上箭头所指部位为相应的限制酶的切割位点。质粒中lacZ基因编码产生的酶可以分解培养基中的X-gal，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。请回答下列问题：

   

(1)过程①为了防止目的基因和质粒的自身环化，选用限制酶的最佳方案是___。

A．只有BamHI	B．BamHI和EcoRI
C．EcoRV和BamHI	D．EcoRV和EcoRI

(2)限制酶切割后，需要用DNA连接酶连接形成重组DNA分子，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是___。
(3)构建基因表达载体时，一般将目的基因插在启动子和终止子之间。启动子的作用是___。
(4)基因工程的四步程序是目的基因的获取、构建基因表达载体、___和目的基因的检测与鉴定。其中构建基因表达载体时，所用载体除了质粒以外，还有___（答出2点）。
(5)过程②处理大肠杆菌后，大肠杆菌处于___的生理状态。
(6)为了筛选含目的基因表达载体的大肠杆菌，可在培养大肠杆菌的通用培养基中额外加入___，培养一段时间后挑选出___（填“蓝色”或“白色”）的菌落进一步培养，从而获得大量目的菌。
(7)目的基因导入受体细胞后，常用___技术检测目的基因是否翻译出乙肝病毒外壳。

【推荐2】某动物体内含有研究者感兴趣的目的基因，研究者欲将该基因导入大肠杆菌的质粒中保存。该质粒含有氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、LacZ基因及一些酶切位点，其结构和简单的操作步骤如下图所示。回答下列问题：

(1)制备重组质粒常用同种限制酶的原因是能产生_____。为了使质粒DNA与目的基因能连接形成重组质粒，还需要在混合物中加_____。
(2)培养基中除了加入大肠杆菌所必需的营养物质外，还需要添加_____以便筛选导入目的基因的大肠杆菌。
(3)为了使大肠杆菌处于一种能_____的生理状态，一般先用Ca²⁺处理大肠杆菌细胞。
(4)将质粒和目的基因的混合物与上述处理后的大肠杆菌混匀，制备转基因大肠杆菌，取0．1ml上述溶液采用_____法接种于培养基表面，在37℃下倒置培养16 h。经培养后，分别统计转目的基因大肠杆菌的菌落数和总菌落数，并计算转化效率。理论上转目的基因受体菌的菌落呈现_____色，原因是_____。实验中实际转化效率介于50%～85．7%，原因是_____。

【推荐3】瘦素是一种由脂肪组织合成和分泌的肽类激素。P载体含有的绿色荧光蛋白（GFP）基因能在真核细胞中表达GFP。将目的基因插入GFP基因后，能表达出目的蛋白和GFP的融合蛋白，根据荧光的强弱，可确定目的基因在细胞内的表达情况。为研究瘦素的功能，科学家构建了瘦素基因真核表达载体，检测疫素基因在小鼠成纤维细胞中的表达情况。瘦素基因及载体的结构如图所示。回答下列问题。

(1)PCR扩增瘦素基因时，与引物1互补的a链左侧是脱氧核苷酸链的______（填“5′”或“3′”）端。据图推测，构建该基因表达载体时，P载体上应有启动子、终止子、标记基因、复制原点、________，以便与酶切后的瘦素基因正确连接。
(2)已知HindIII和BamHI在P载体上的切割位点非常接近。为确定重组质粒是否构建成功，用HindIII、BamHI分别对瘦素基因PCR产物、P载体和重组质粒双酶切，再进行电泳，结果如图所示。请在图中将P载体和重组质粒酶切结果对应位置的条带涂黑______。

(3)Kanr/Neor是一种抗性基因，在真核细胞中表达具有新霉素抗性，而在原核细胞中表达具有卡那霉素抗性。本实验中为筛选转化的细胞，应在培养基中添加________。
(4)为检测瘦素基因是否成功表达，可用的鉴定方法是_______（答出2种）。为进一步获得更多能表达融合蛋白的细胞，还需要进行_______。