【推荐1】透明质酸酶是一种能够降低体内透明质酸的活性，从而提高组织中液体渗透能力的酶。下图是利用重叠延伸PCR技术获得新透明质酸酶基因的过程，NcoI和XhoI为限制酶识别位点。请分析回答下列问题：

（1）图中新透明质酸酶基因的获得是重叠延伸PCR技术在__________(基因敲除／基因的定点突变／融合基因的构建)方面的应用。透明质酸酶基因上的一段核苷酸序列为“-ATCTCGAGCGGG-”，则对该段核苷酸序列进行剪切的XhoI酶识别的核苷酸序列(6个核苷酸)为___________________。
（2）构建透明质酸酶基因表达载体时，使用的载体往往有特殊的标记基因，其作用是_________________；所用的DNA连接酶对所连接的DNA两端碱基序列________(有／没有)专一性要求。早期利用大肠杆菌作为受体细胞，后来发现毛霉或酵母菌更具优势，最可能的原因是_________________________。
（3）人体细胞间质有基膜粘连蛋白、多糖(如透明质酸)、蛋白多糖等成分。动物细胞培养时将取出的组织块分散成单个细胞的做法为____________________。链球菌等致病菌在侵染人体时，可产生透明质酸酶，试分析透明质酸酶在链球菌侵染过程中的作用是______________，其意义可能是____________________________________

【推荐2】下图为冠状流感病毒的结构示意图，其中蛋白M能刺激机体产生免疫反应，蛋白S通过与宿主细胞表面的受体特异性结合而进入细胞。对冠状流感病毒的检测是临床诊断的依据，主要有抗体检测、抗原检测、核酸检测三大类。回答下列问题：

(1)冠状流感病毒的RNA不能直接进行PCR扩增，先以________________________为模板，通过________过程合成cDNA，必须依据________________________来设计引物，然后在扩增产物中加入特异的核酸探针进行检测。
(2)间接免疫荧光法如下图所示：把冠状流感病毒标本固定在玻片上，然后将待测病人的血清滴在玻片上，待反应后，再加入荧光素标记的第二抗体（与第一抗体特异性结合），若待测病人为冠状流感病毒感染者，洗涤后在荧光显微镜下观察，会出现________现象。此方法属于上述三大类方法中的________检测。


(3)下图是利用基因工程研制冠状流感病毒疫苗的技术路线。其核心步骤是过程________（填标号），重组DNA中含有的组件包括____________________（答出2点即可）。图中蛋白X应选用的是________（填“蛋白S”或“蛋白M”），理由是______________________。


(4)疫苗Ⅰ可直接作为________激发人体的免疫反应并产生_________。疫苗Ⅱ导入实验动物体内，______（填“一定”或“不一定”）能引起免疫反应，理由是____________________。

【推荐3】TGF-β信号通路可通过S蛋白去磷酸化抑制癌细胞增殖。该过程中N蛋白磷酸化后被激活，可使S蛋白发生磷酸化；药物SPD可通过影响R蛋白来增强细胞对TGF-β信号通路的响应。为探索药物SPD治疗癌症的机理，需构建基因表达载体以获得融合蛋白S-HA、N-HA和R-HA。HA是一种短肽，连接在S、N或R蛋白的羧基端（不影响S、N或R的功能），细胞中只有带HA标签的融合蛋白能与介质上的HA抗体结合，从而分离得到HA标签融合蛋白。
(1)若将基因表达载体导入大肠杆菌中表达融合蛋白，导入之前对目的基因进行PCR扩增时应以___（填“基因组DNA”或“cDNA”）为模板。
(2)用于PCR扩增S基因的引物5端分别加入了限制酶NheI和HindⅢ的识别序列，将扩增后的S基因插入载体上，构建含S-HA融合基因的表达载体，如图1所示，其中“TACCCAT”是HA编码链的起始序列。将重组载体导入细胞后，表达的蛋白有S蛋白的氨基酸序列但没有HA的氨基酸序列，据图1分析，出现该问题的原因是___。该问题解决后将重组载体再次导入细胞，表达出了融合蛋白，但却不是所需的融合蛋白，据图1分析，可能的原因是___。

(3)融合蛋白表达成功并分离得到R-HA和磷酸化的S-HA、N-HA。将三种融合蛋白按照图2所示的组合方式分别在缓冲液中进行反应，检测S-HA和N-HA的磷酸化水平，结果如图2所示，推测R蛋白的作用是___。向细胞培养液中加入不同浓度SPD处理相同时间，通过电泳检测细胞中R蛋白水平，结果如图3所示，推测SPD对R蛋白的影响是___。

(4)据以上结果推测，药物SPD治疗癌症的机理是___。

【推荐1】多聚半乳糖醛酸酶（PG）能降解果胶使细胞壁破损。番茄果实成熟中，PG合成显著增加，能使果实变红变软，但不利于保鲜。利用基因工程的方法减少PG基因的表达，可延长果实保质期。科学家将PG基因反向接到Ti质粒上，导入到番茄细胞中，得到转基因番茄。请根据下图回答：

（1）提取目的基因
①若已获取PG的mRNA，可通过________________获取PG基因。
②在该基因上游加结构A可确保基因的反向转录，结构A上应具有___________结合位点。得到的目的基因两侧需人工合成BamHI黏性末端。已知BamHI的识别序列如图甲所示，请在下图乙相应位置上，画出目的基因两侧的黏性末端。_______

③重组质粒转化到大肠杆菌中的目的是________________________。
（2）用含目的基因的农杆菌感染番茄原生质体后，可用含有__________的培养基进行筛选，与此同时，为能更好地达到培养目的，还需在培养基中加入______________________。培养24～48h后取样，在质量分数为25%的蔗糖溶液中，观察细胞_____________现象来鉴别细胞壁是否再生。
（3）由于导入的目的基因能转录反义RNA，且能与________________________互补结合，抑制PG基因的正常表达。若转基因番茄的保质期比非转基因番茄_______，则可确定转基因番茄成功。
（4）获得的转基因番茄产生的种子不一定保留目的基因，科研人员常采用 ________方法使子代保持转基因的优良性状。

【推荐2】基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，包括以下几个环节：目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。回答下列相关问题：
（1）在基因工程中，获取目的基因主要有两大途径，即____________和从生物材料中分离。如果利用某植物为材料，同时构建cDNA文库和基因组文库，两者相比cDNA文库中含有的基因数目比基因组文库中的__________（多/少）。
（2）在构建基因表达载体时，经常使用质粒载体作为基因工程的工具，其应具备的基本条件有__________（答出两点即可）。除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。启动子是__________酶识别并结合的部位。这一步骤中通常还会利用到DNA连接酶，常见的有E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是__________。
（3）将目的基因导入受体细胞时，如果受体为植物细胞，采用最多的方法是__________，如果受体为动物细胞，采用最多的方法是__________。
（4）最后，要检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因，经常采用的检测方法是_______________。

【推荐3】甘蓝型油菜引入我国历史较短，其遗传基础狭隘。菘蓝（别名“板蓝根”）是传统中药材，具有广谱抗病毒特性。研究人员利用甘蓝型油菜（体细胞中染色体数为38）与菘蓝（体细胞中染色体数为14）进行体细胞杂交，培育抗病毒的甘蓝型油菜-菘蓝单体附加系，过程如图1。

(1)甘蓝型油菜与菘蓝的体细胞经__________酶处理后获得原生质体，再经__________诱导获得融合细胞。融合细胞接种到含有营养物质和__________的培养基上，经__________过程形成愈伤组织，发育形成完整的再生植株F₁。
(2)将F₁与甘蓝型油菜回交，获得BC₁，其染色体组成为__________（只用字母表示）。用BC₁与甘蓝型油菜再一次回交，得到的BC₂植株群体的染色体数目范围是_______。
(3)研究人员从BC₂筛选出7种只含有1条菘蓝染色体的甘蓝型油菜-菘蓝单体附加系（A、B、C、D、E、F、G）。为探究甘蓝型油菜-菘蓝单体附加系在抗新冠病毒（SARS-CoV-2）中的作用，研究人员用其提取物处理动物细胞，24h后感染新冠病毒，一段时间后收集病毒细胞培养液，检测病毒的含量，结果如图2。

       

①作为标准参考的GADPH蛋白表达量__________，可排除无关变量对实验结果的影响。
②结果表明：__________。
③尝试说出建立甘蓝型油菜-菘蓝单体附加系在育种方面的意义：__________。（答出两个方面）
Ⅱ.母源因子是初级卵母细胞在减数分裂Ⅰ前期的后段开始产生并积累的mRNA和蛋白质，其对于调控动物早期胚胎的发育十分重要。为研究不同母源因子的功能，相应母源突变体的培育显得尤为重要。
(4)母源因子由母源效应基因通过基因__________过程产生，其产生并积累的时期由于同源染色体未分离，因此只有纯合突变的雌性个体的后代才是母源突变体。
(5)传统交配筛选的方法存在耗时长、纯合的合子突变体的致死率高等缺陷。为了解决上述问题，科学家在CRISPR/Cas9基因编辑系统的基础上进行了改进。
①sgRNA编码序列能与相应靶基因序列发生碱基互补配对。为构建含有sgRNA编码序列的重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA用__________处理，然后将其插到经相同酶处理过的质粒上。斑马鱼的卵母细胞与精子受精前停滞在减数分裂Ⅰ前期，此时还未开始合成母源因子，在此阶段前对卵母细胞进行基因敲除可避免母源因子的积累。
②为了实现卵母细胞中基因的特异性敲除，如图2所示，科学家将含有3个不同的但靶向相同基因的sgRNA编码基因的重组质粒组装到具有特殊元件的载体上，形成新的重组质粒后导入卵母细胞。

注：eflap—能够驱动基因广泛表达的启动子；EGFP—增强型绿色荧光蛋白基因；I-SecI一归位内切酶，可将质粒随机插到斑马鱼的基因组中。
从理论上分析，一个sgRNA便能实现靶基因的敲除，请分析3个sgRNA串联有何优势，请答出2点__________。

【推荐1】普通棉花中含β-甘露糖苷酶基因（GhMnaA2），能在纤维细胞中特异性表达，产生的β-甘露糖苷酶催化半纤维素降解，棉纤维长度变短。为了培育新的棉花品种，科研人员构建了反义 GhMnaA2基因表达载体，利用农杆菌转化法导入棉花细胞，成功获得转基因棉花品种，具体过程如下。其中SmaⅠ、NotⅠ、HindⅢ、 BamHⅠ四种限制酶的识别序列和酶切位点分别为 CCC↓GGG、 GC↓GGCCGC、A↓GCTT、 G↓GATCC。请分析回答：

（1）①过程中所用的限制性内切酶是___________。用SmaⅠ切割DNA后形成_____末端。影响限制酶处理效果的因素可能有___________。
①反应温度       ②缓冲液pH     ③限制酶的浓度       ④DNA样品的纯度
（2）基因表达载体除了图示组成外，至少还有___________等（至少答两个）。
（3）③过程中用酶切法可鉴定正、反义表达载体。SmaⅠ酶和NotⅠ酶切正义基因表达载体获得0．05kb、3．25kb、5．95kb、9．45kb四种长度的DNA片段，则用NotⅠ酶切反义基因表达载体获得DNA片段的长度应是___________kb和___________kb。
（4）④过程表示利用农杆菌介导转化棉花细胞的过程。农杆菌中可以整合到棉花细胞染色体DNA的区段是___________。
（5）导入细胞内的反义 GhMnaA2转录的mRNA能与胞内的 GhMna2转录的mRNA互补配对，从而抑制基因的表达，其意义是______________________。

【推荐2】研究人员将抗盐基因转入普通烟草培育出抗盐烟草，该过程所用的质粒与含抗盐基因的DNA上相关限制酶的酶切位点分别如下图1、图2所示。下图3表示该过程中利用含目的基因的农杆菌进行转化的示意图。请回答下列问题：

限制酶种类	BamHI	BclI	Sau3AI	HindⅢ
识别序列及切割位点	G↓GATCC	T↓GATCA	LGATC	A↓AGCTT

(1)图1质粒中没有标注出来的基本结构是___。
(2)用图中质粒和目的基因构建基因表达载体时，应选用限制酶___同时切割质粒和含目的基因的DNA片段。
(3)将上述切开的质粒与目的基因混合，加入DNA连接酶连接后，导入受体细胞，受体细胞的类型可能包含___（不考虑基因突变）。
①抗X、抗Y②抗X、不抗Y③不抗X、抗Y④不抗X、不抗Y
(4)农杆菌能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，其原因是当植物体受损伤时，伤口处的细胞会___；烟草细胞与农杆菌共培养的目的是利用农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可以___的特性。
(5)在目的基因的检测与鉴定中，检测目的基因是否发挥功能作用的第一步是___。

【推荐3】研究人员将乙肝病毒的表面抗原（HBsAg)基因转入番茄幼叶细胞中，获得能产生乙肝疫苗的番茄植株。回答下列问题：
（1）利用PCR技术扩增HBsAg基因时，目的基因DNA受热变性后的单链与引物互补序列结合，在_______酶的作用下进行延伸。设计的引物含有ClaⅠ酶切位点和SacⅠ酶切位点，用作载体的DNA分子________(填“含有”或“不含有”）ClaⅠ酶切位点和SacⅠ酶切位点，理由是________________。
（2）将HBsAg基因导入番茄幼叶细胞最常用的方法是______________，该方法可以使目的基因插入到细胞中______________的DNA上。
（3）可利用植物组织培养技术获得转基因番茄植株，该技术利用的原理是________________。
（4）通过电镜对番茄果实提取物进行观察，发现了HBsAg颗粒，说明目的基因导入受体细胞后_________。用获得的转基因番茄果实饲喂小鼠，如果在小鼠血清中检测到_____________，说明转基因植物疫苗可口服。

【推荐1】急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）患者的胰腺组织，由于自身消化、水肿、出血甚至会坏死，所以具有很高的致病率与致死率。以往研究成果发现细胞自噬是引起急性胰腺炎的主要原因。在前期实验中发现AP的细胞中MasⅠ基因表达量异常，故推测该基因表达量的变化可能对AP细胞自噬有影响。为证明这一推测，科研人员做了如下实验。请据此回答：
(1)取小鼠胰腺的组织，剪碎、并用_____处理，使细胞分散以便进行_____代培养。与植物组织培养相比，培养动物细胞的培养基中不需要添加_________等物质，这样可以模拟动物细胞在体内的环境。
(2)已知雨蛙素（CAE）可以诱导细胞自噬。一些小分子RNA（siRNA）可以特异性的降解同源mRNA，从而抑制特定基因的表达。通过DNA重组技术导入特定的基因可以使细胞中该的基因表达量提高。下表显示了部分实验处理方法，“+”表示施加处理，“-”表示不施加处理，请在①②③后面的横线处填“+”或“-”，以完善实验方案：

处理方法	A 组	B组	C组	D组
加入雨蛙素	-	+	①	+
导入 MasⅠ-siRNA	-	-	+	②
导入 MasⅠ基因	-	-	③	+

处理①_____；处理②________；处理③_____。
(3)细胞中的LC3蛋白表达量同细胞自噬程度呈正相关，可以使用_____法检测细胞中LC3的表达量，用以反映细胞自噬的情况。实验结果如图所示：

注：图中红色荧光的分布范围和亮度与LC3蛋白的表达量呈正相关
分析实验结果可知，与MasⅠ基因低表达组相比，高表达组细胞自噬现象_____。由此提示，若能_________________________________________，则有利于保护AP细胞。

【推荐3】已知组成型启动子可以高效地启动目的基因在植物各种组织中的表达，但常会阻碍植物的生长发育。诱导型启动子可在特定环境条件下诱导目的基因的表达。沙冬青脱水素基因（AmDHN基因）能使植株具有较强的抗旱作用。科研人员通过构建AmDHN基因表达载体，以培育耐旱苜蓿新品种，所用载体如下图所示，请回答下列问题：
   
(1)用载体1构建含AmDHN目的基因的表达载体，可以成功转化苜蓿，但会出现抑制抗性芽生长和抗性植株生根的现象，推测³⁵S启动子属于_________启动子。
(2)下图是科研人员扩增Rd29A启动子所设计的引物，根据引物的碱基序列及限制酶的识别序列分析，构建载体2时选用的限制酶是________________。为了改造载体1中的启动子，需要用________________酶切割载体1、2为最佳。
上游引物P1：5＇-GACCCGGGTTTCCAAAGATTTTTTTC-3＇
下游引物P2：5＇-GAGAGCTCTGGGGTTTTGCTTTTGAATGT-3＇
(3)构建Rd29A启动子驱动AmDHN基因的表达载体后，先将其导入________，再转化苜蓿。转化后应在培养基中添加________进行筛选。
(4)为检测转基因苜蓿中AmDHN基因的表达水平，科研人员做了相关实验。下表呈现了部分操作步骤，请完成表格：

实验步骤的目的	简要操作过程
①_______	在转基因无菌苗根系长至 2～3 cm 时，将培养无菌苗三角瓶的封口膜打开，培养一周，观察其生长状况
提供适宜生长条件	将甲组幼苗根系置于300mL水中
模拟干旱胁迫条件	②____________
无关变量控制	将甲、乙两组置于温度、光照等条件适宜且相同的环境中培养8h，之后剪取两组叶片放在液氮中储存
③________	对叶片研磨、离心后，提取④________，以AmDHN和MtActin基因⑤________为依据设计引物，进行RT-PCR扩增，其中MtActin（一种细胞骨架蛋白）为内参。扩增产物用⑥ _______检测，EB（溴化乙锭）染色照相如图。