【推荐1】现代生物科技中筛选是一个重要过程。请回答下列技术有关筛选问题：

（1）过程③是杂交瘤细胞的培养，在体外培养时培养基中需要提供一定浓度的CO₂，目的是_______。杂交瘤细胞需要经过两次筛选，第一次筛选的目的是_________。
（2）过程②诱导融合运用的原理是_______，该过程中区别于植物原声质体融合的方法是用________
处理。植物原生质体融合后，需从_______种两两融合的细胞中筛选出杂种细胞的原声质体。
（3）研究人员采用PCR技术获取酶D基因和转运肽基因，该技术是利用________ 的原理，使相应基因呈指数增加。所含三种限制酶（XbaⅠ、ClaⅠ、SacⅠ）的切点如图所示，则用______和________处理两个基因后，可得到酶D基因和转运肽基因的重组基因，选用这两种酶的原因是_________。

【推荐2】猪瘟病毒能与猪细胞膜上的LamR受体蛋白结合，进而侵入细胞引起猪瘟。利用基因编辑技术改变LamR受体蛋白基因，使LamR受体蛋白不能与猪瘟病毒正常结合，但不影响其生理功能，从而培育出抗猪瘟病毒猪。该技术主要由Cas9蛋白与向导RNA的复合物共同完成（如图1所示），其中向导RNA可识别LamR基因中的特定序列。

(1)图1中向导RNA与LamR基因按照______原则特异性结合，Cas9蛋白切割LamR基因作用的化学键为_______。DNA双链断裂后，再通过随机增添、删除或替换部分碱基对，从而实现对LamR基因改造。实验发现，CRISRP/Cas9基因编辑技术有时存在编辑对象出错而造成“脱靶”，向导RNA的序列越短脱靶率越高。试分析脱靶最可能的原因_______。
(2)将改造好的LamR基因进行PCR扩增，由于LamR基因两端没有限制酶识别序列，为了保证LamR基因能正确插入质粒（如图2）中，需要在两种引物的5’端分别添加_______限制酶的识别序列。至少扩增________次即可出现两端带上限制酶识别序列的LamR基因。
(3)构建好基因表达载体后，可用_______方法将重组质粒导入到猪受精卵中。请写出从个体水平检测抗猪瘟病毒猪培育成功的方法_______。

【推荐1】我国是世界最大的棉花消费国、第二大棉花生产国。利用基因工程技术获得的转基因抗虫棉投入种植生产已经非常成熟，尤其是我国独创的花粉管通道法更是一种十分简便经济的方法，为推动基因工程技术的发展也做出了贡献。
（1）花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后滴加_____（填“目的基因”或“含目的基因的表达载体”），使目的基因借助花粉管通道进入_____。
（2）目的基因导入后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过_____才能知道。为确定转基因棉花的DNA上是否插入了目的基因和转基因棉花的目的基因是否成功转录，都会用到分子杂交技术，但两者从杂交对象上的区别是_____。
（3）为检验棉花植株是否被赋予抗虫特性，可以在个体水平上做_____实验。如果抗虫基因导入成功，且与某一条染色体的DNA整合起来，该转基因抗虫棉可视为杂合子，将该转基因抗虫棉自交一代，预计后代中抗虫植株的比例占_____。
（4）基因工程在原则上只能生产自然界_____（选填“已存在”或“不存在”）的蛋白质，这些蛋白质不一定完全符合人类生产和生活的需求。因此，在基因工程基础上产生了蛋白质工程，通过_____，对现有蛋白质进行改造，或制造新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。

【推荐2】根据基因工程的有关知识，回答下列问题。
（1）质粒运载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下：

为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种限制性核酸内切酶切割，该酶必须具有的特点是____________。
（2）按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即_________和__________。
（3）若要在体外获得大量反转录产物，常采用____________技术。
（4）基因工程中除质粒外，____________和____________也可作为运载体。
（5）若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是____________。

【推荐3】荔枝、龙眼果实风味佳，而成熟荔枝极不耐保存。科研人员利用转基因技术和植物体细胞杂交技术对荔枝、龙眼的育种开展研究。请回答下列问题：
(1)荔枝愈伤组织分化的胚状体在培养时存在严重玻璃化、畸形胚多的现象，科研人员通常采用___________(填方法)导入外源hpt基因和gus基因，来获得稳定再生胚性愈伤组织(TPEC)。培养荔枝愈伤组织的培养基中除需要添加无机营养成分、有机背养成分外，还需要添加______________(答出两点即可)等。
(2)用__________技术可以检测TPEC细胞稳定表达的gus蛋白。选取部分细胞在一定溶液中用________(填酶的名称)处理后可以获得原生质体。
(3)用黄绿色的异硫氰酸荧光素标记荔枝TPEC细胞的原生质体，用红色的异硫氰酸碱性蕊香红标记龙眼细胞的原生质体。将两种原生质体按1：1的比例在电融仪中诱导融合，原生质体融合的原理是________________________________________。
(4)杂种细胞的筛选工作至关重要，荧光显微镜下筛选杂种细胞的方法是_______________。

【推荐1】如图是利用现代生物工程技术治疗遗传性糖尿病（基因缺陷导致胰岛B细胞不能正常合成胰岛素）的过程设计图解，请据图回答：

（1）图中①所示的生物工程技术是_____；图中②所示的生物工程技术是_____。
（2）在图中④所示的生物工程技术中，健康胰岛B细胞基因在导入③之前要构建_____，这个步骤是基因工程的核心，构建出的分子除含目的基因外，还必须含有_____。
（3）重组细胞B在一定的_____如牛磺酸、丁酰环腺苷酸等的作用下，可以定向分化形成胰岛B细胞。培养重组细胞B的培养液中除加入各种营养物质外，还必须加入_____等一些天然成分，放在含O₂和CO₂的环境中培养，其中CO₂的作用是_____。
（4）图示方法与一般的异体移植相比最大的优点是_____。

【推荐2】重组人血小板生成素（rhTPO）是一种新发现的造血生长因子，如图为通过乳腺生物发生器产生rhTPO的相关过程。

（1）在获取目的基因时____________（填“能”或“不能”）用Smal，原因是____________，重组质粒中的标记基因是 ____________，标记基因的作用是____________。
（2）通常采用_________技术将重组质粒导入受精卵，图中所示的过程与胚胎工程相关的有_______（至少写出两个）。
（3）采用SRY— PCR方法对早期胚胎进行性别鉴定，样本细胞取自____________，以Y染色体中含有的特异性SRY基因为探针，通过____________方法进行胚胎的性别鉴定。

【推荐3】Ⅰ．下图是利用现代生物工程技术治疗遗传性糖尿病（基因缺陷导致胰岛B细胞不能正常合成胰岛素）的过程设计图解，请据图回答：

（1）图中①、③所示的结构分别是____________、_____________。
（2）图中②、④所示的生物工程技术分别是________、____________。此外图示过程还应用了哪些生物工程技术？__________________。
（3）图示方法与一般的异体移植相比最大的优点是_____________。
Ⅱ．目前，科学家正致力于应用生物技术进行一些疾病的治疗，如器官移植、基因治疗等。请回答下列问题：
（1）人体器官移植面临的主要问题有_____和免疫排斥，目前临床通过使用______抑制_______的增殖来提高器官移植的成活率。
（2）人们发现小型猪的器官可用来替代人体器官进行移植，但小型猪器官表面的某些抗原决定簇仍可引起免疫排斥。目前，科学家正试图利用基因工程对小型猪的器官进行改造，采用的方法是将器官供体基因组导入某种调节因子，以抑制________，或设法除去__，再结合克隆技术，培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。
（3）基因工程技术还可用于基因治疗。在进行体外基因治疗时，最有效的转化方法是__________；在进行体内基因治疗时，采用的载体应该是_______________。

【推荐1】我国科学家利用CRISPR/Cas9基因编辑技术（如图所示）对小鼠基因进行定点敲除或者替换，构建相应的模型小鼠应用于医学研究。回答下列问题：

(1)科学家根据DNA靶片段序列设计单链引导RNA，随后可利用PCR技术进行体外扩增，该技术依据的原理是_____，每一个PCR循环要经过_____三个阶段。
(2)单链引导RNA能特异性识别靶向DNA序列，这一过程运用了_____原则。结合后Cas9蛋白能剪切DNA，断开_____键，Cas9蛋白相当于基因工程中的_____。
(3)单链引导RNA、Cas9蛋白等混合后，可通过_____技术导入小鼠受精卵内。为获得更多的小鼠受精卵，研究人员可对雌鼠注射_____使其排出更多的卵子。
(4)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行基因敲除的应用价值有_____（写一点）。

【推荐2】CRISPR-Cas9技术是一种应用广泛的基因编辑技术，通过人工设计的sgRNA（guideRNA）来识别目的基因组序列，并引导Cas9蛋白酶进行有效切割DNA双链，形成双链断裂，损伤后修复会造成基因敲除或敲入等，最终达到对基因组DNA进行修饰的目的。科学家利用CRISPR-Cas9技术将抑癌基因△Np63a定点插入小鼠胰腺癌细胞中，以研究其在胰腺癌细胞中的作用。图1为构建的Cas9—sgRNA质粒，将其导入胰腺癌细胞并表达（图2）；携带△Np63a基因的供体质粒与断裂DNA的高度同源序列（同源臂）发生互换，从而将△Np63a基因定点插入胰腺癌细胞基因组中（如图3所示）。请回答下列问题：

   

(1)Cas9蛋白可对特定的DNA序列切割，在功能上最接近于________酶；一次切割过程中会产生__________个游离的磷酸基团；将Cas9-sgRNA质粒和供体质粒导入胰腺癌细胞的方法是_________。
(2)若已知靶序列5'-GCATCG…GGTCCC-3'，根据该靶序列设计的sgRNA中的相应序列是5'-__________-3'。若要将靶序列从目标DNA上切除下来，则需要设计________种不同的sgRNA。
(3)CRISPR-Cas9系统有时存在结合出错而出现“脱靶”现象，分析其可能原因是_________。
(4)若要检测△Np63a基因是否已导入成功，可使用__________技术。被△Np63a基因成功转化的胰腺癌细胞体外培养时，在细胞水平上可能发生的变化有________。
(5)在上述基因编辑过程中，下列核酸序列中应已知碱基序列的有_____________。

A．sgRNA识别序列	B．同源臂1
C．同源臂2	D．CMV启动子

【推荐3】研究发现，帕金森等人类神经退行性疾病与R环结构有关。R环（转录形成的mRNA分子难与模板链分离，而形成的RNA—DNA杂交体，由一条mRNA与DNA杂合链及一条DNA单链所组成。

(1)mRNA与模板链通过___________连接。
(2)mRNA形成需要___________酶催化，依据___________原则mRNA能准确获取其模板链所携带的遗传信息。
(3)据题意推测R环区域模板DNA单链中___________碱基比例比较高（填A、T或G、C），因此我们可以依据密码子的简并性，通过基因定点编辑技术（在精确的位点剪断靶标DNA片段并插入新的基因片段），降低R环形成的概率，基因定点编辑过程中有_______键的断裂和重新形成。
(4)R环中，嘌呤碱基总数与啶碱基总数一定相等吗？________（填“一定”或“不一定”），请说明理由：___________________。