【推荐1】同源重组技术结合tet^r-sacB双重选择系统可对基因进行敲除与回补，研究基因的功能。下图是科研人员利用该方法对大肠杆菌tacZ基因进行敲除与回补的相关过程，其中tet^r是四环素抗性基因，sacB基因（2071bp）是蔗糖致死基因，LacZ基因表达产物能将无色化合物X-gal水解成蓝色化合物。请回答下列问题：

   

(1)过程①PCR除需要加入Taq酶、dNTP、缓冲液、Mg²⁺外，还需加入______，所加dNTP的作用有______。
(2)为保证sacB基因和质粒2定向连接，设计引物P₁、P₂时，需在引物5'端添加限制酶_____的识别序列；过程②需要限制酶和________酶。
(3)过程③中，需先用Ca²⁺处理大肠杆菌，使其成为_______细胞。筛选导入质粒3的大肠杆菌时需在培养基中添加________。
(4)下图是对质粒3转化菌落进行PCR验证时的产物电泳结果，泳道4、5、7对应的菌株可能转化成功，判断的理由是______。过程⑤PCR中设计引物P₃、P₄时，需在引物5′端分别添加_______基因两端的同源序列。

   

(5)过程⑦中，在含有四环素和_____的培养基中出现了白色菌落，即为筛选出的敲除LacZ基因菌株。过程⑧通过同源重组技术结合tet^r-sacB双重选择系统可对LacZ基因进行回补，筛选LacZ基因回补菌株时应在培养基中添加_____。

【推荐2】血凝集素基因（HA）编码的血凝激素是构成流感病毒囊膜纤突的主要成分。成熟的血凝集素包含HA₁和HA₂两个亚单位，其中HA₁含有病毒与受体相互作用的位点。IgGFc基因片段（长度为717bp）编码人IgG抗体中的一段小肽，常作为融合蛋白标签。蛋白质分泌依赖于信号肽的引导，本研究中用信号肽IL-2SS代替HA自身信号肽，科研人员尝试构建IL-2SS／HA₁／IgGFc融合蛋白表达载体，并导入大肠杆菌表达和分泌。
   
(1)本实验中信号肽IL-2SS的作用是______，PCR扩增目的基因时应该选择图中引物______。设计引物时，不能包含基因HA₁的终止密码子的编码序列，原因是______。
(2)应选择限制酶______来切割质粒A，然后直接将PCR产物与质粒A混合，同时加入______酶，使得目的基因与质粒A相连。
(3)若目的基因与质粒A正向连接，HA₁基因转录时的模板链是由图中的引物______（填“a”、“b”、“c”或“d”）在PCR时延伸而成；若目的基因与质粒A反向连接，用BamHI和SacI同时切割重组质粒，完全酶切后的产物进行凝胶电泳，其中最靠近加样孔的条带长度约为______bp。
(4)融合蛋白中的标签蛋白有利于目的蛋白的分离和纯化，基因工程生产HA₁作为疫苗时，选择人IgGFc作为标签的优点还有______。

【推荐3】单链全人源抗体scFv由轻链1/2的可变区（VL）、重链1/4的可变区（VH）通过短肽连接构成。借助噬菌体展示技术制备单克隆scFv的过程为：首先从已免疫B细胞中提取mRNA先后进行RT-PCR（逆转录PCR）、重叠PCR，制得由VL-Linker-VH构成的融合基因scFv库（图1，其中6个箭头表示重叠PCR过程中引物结合部位，scFv的首尾各含有一个由6个核苷酸组成的限制酶识别序列），其次将scFv库与噬菌粒（图2，是由质粒的部分基因与噬菌体的部分基因构成）连接成表达载体库，再在噬菌粒表达载体库转染TG1等大肠杆菌的基础上，用辅助噬菌体协助感染，获取表面展示有scFv的噬菌体库（图3，该噬菌体的遗传物质为带有scFv的单链环状DNA），最后采用亲和层析柱对噬菌体抗体库进行筛选，获得特定的单克隆scFv。   

(1)下列①～⑥是图1中引物，其中1R为①，则1F、R分别为________、________，scFy首端限制酶识别序列为________。
①5'-GATCGCCCCGCATGCCGCGAGAGCCACTGACGAGTCCGC-3'
②5'-GCGGCATGCGGGGCGATCGCGTGACTGCCAGTGCTGTCC-3'
③5'-GTATACCATATGCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGC-3'
④5'-CAGCCTGCGCCCGTTTGCGTCCGAGCCATGCCAC-3'
⑤5'-GTGGCATGGCTCGGACGCAAACGGGCGCAGGCTG-3'
⑥5'-ATTTCTCGAGTTACTTGGAGGCAGTCATGAAGCTG-3'
(2)噬菌粒表达载体中，质粒复制原点的作用是________，被噬菌粒表达载体转染的大肠杆菌在含有________（物质）的培养基中才能表达scFv。
(3)噬菌体复制原点的作用是________，启动其发挥作用的蛋白质启动因子是由________指导、在________上合成的；为保证展示scFv噬菌体的遗传物质为带scFv的单链环状DNA，辅助噬菌体必须具有的缺陷是________。
(4)固定在亲和层析柱上用于结合特定scFv的配体是________。
(5)与传统鼠源单克隆抗体相比，单克隆scFv的优点是________。

【推荐1】病毒HPV持续感染可导致宫颈癌发生。科研人员将HPV外壳L1蛋白基因，与在人体中不能复制但能有效表达外源基因的痘苗病毒重组，制备新型疫苗。
（1）用痘苗病毒感染鸡胚细胞，一段时间后洗去吸附的病毒，将鸡胚细胞转入液体培养基中培养，培养基中加入适量抗生素以避免_______。在培养基中加入L1蛋白基因与质粒连接构建的重组质粒，使L1蛋白基因与痘苗病毒DNA在鸡胚细胞内发生DNA重组，得到重组病毒疫苗。依据Ll基因序列设计引物扩增重组病毒DNA，以检测____________________。
（2）为研究重组疫苗的保护作用，将生长发育状况一致的小鼠随机均分为三组，1组注射用PBS缓冲液配制的重组病毒疫苗100μL，2组注射100μL PBS缓冲液配制的痘苗病毒作为对照，3组注射_________作为空白对照。
（3）给上述三组小鼠皮下注射C3细胞（含有HPV基因的癌细胞），观察、记录小鼠成瘤情况，结果如下。据实验结果分析，尽管各组小鼠都可成瘤，但实验组小鼠______、______、______，说明重组病毒疫苗具有一定的免疫保护作用。

组别	各组平均瘤重（g）
1	0.192
2	0.347
3	0.916

（4）接种重组病毒疫苗的小鼠体内表达____________作为抗原，刺激机体产生特异性免疫。皮下注射C3细胞时，HPV引起______________细胞迅速增殖、分化，产生大量抗体，从而起到免疫保护作用。根据免疫学知识，注射疫苗后，只有诱发出机体的____免疫，才能有效清除癌细胞。

【推荐2】科学家将C-Myc（原癌基因）、KI4（抑癌基因）、Sox2和Oct4等四种关键基因利用病毒转入高度分化的小鼠成纤维细胞内，获得iPS细胞，iPS细胞在适当的诱导条件下，可以定向分化成各种细胞。
(1)利用成纤维细胞获得iPS细胞的过程中，转入c-MyC、KIf4、Sox2和Oct4等的作用是______。iPS细胞的分化程度与______干细胞最接近。题目中所运用的病毒与诱导动物细胞融合时使用的病毒除种类可能不同外，还存在一个明显的区别是______。
(2)在培养过程中，iPS细胞分裂生长到细胞表面相互接触时，细胞会停止分裂增殖，长成致密的单层，这种现象称为______；若需要进行传代培养，需要用胰蛋白酶等处理后再收集细胞制成新的细胞悬液，不用胃蛋白酶处理的原因是______。
(3)2019年科学家利用成纤维细胞→①开启（）基因/关闭（）基因iPS细胞→②开启（）基因/关闭（）基因→角膜细胞过程，制作出一层0．5毫米厚的“眼角膜”细胞薄膜，进行移植并获得成功。下表是在定向诱导培养细胞过程中，成纤维细胞、iPS细胞和角膜细胞的三种基因（FSP-1、SOX-2、K12）及其控制合成的蛋白质的情况。结合表中信息，①和②过程中三种基因开启/关闭的情况分别为：①______，②_______。

	FSP-1		SOX-2		K12
	基因	蛋白质	基因	蛋白质	基因	蛋白质
成纤维细胞	+	+	+	-	+	-
iPS细胞	+	-	+	+	+	-
角膜细胞	+	-	+	-	+	+

【推荐3】肝移植后的患者因使用免疫抑制剂常出现细菌感染而使生存质量下降。有学者就细菌感染对移植肝免疫排斥的影响，进行了如下研究。
(1)实验一：将若干健康、状况相似、体内无病原体的大鼠均分为G₁、G₂、G₃三组。各组大鼠移植A类大鼠肝脏，肝移植术后处理方法见表1。处理n天后，检测各组大鼠的排斥反应程度，结果如表2。

①移植器官中细胞表面的某些蛋白质可作为____，能引起机体产生特异性免疫反应。
②环孢霉素A可以使T细胞的增殖受阻，从而____（填“加强”或“减弱”）免疫系统功能。
③据表2可知，____组免疫排斥反应最为强烈。
(2)实验二：提取实验一处理n天后各组大鼠的淋巴细胞，将其用A类大鼠细胞表面的某些蛋白质处理，之后置于CO₂培养箱内培养。观察各组大鼠淋巴细胞增殖情况，结果如右图所示（相对值的大小用于反映经A类大鼠细胞表面某些蛋白质处理后的细胞增殖能力强弱）。
①CO₂培养箱中CO₂的作用是____。
②与G₁组相比，G₂组实验结果表明，细菌感染对大鼠淋巴细胞增殖能力有____作用。
(3)综合该系列实验的结果推测，细菌感染通过改变肝移植大鼠的____，导致大鼠的免疫排斥反应程度____。此项研究为患者器官移植后免疫抑制剂的使用提供参考。

【推荐1】某种荧光蛋白（GFP）在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白（L1）基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1-GFP融合基因，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点如下图所示，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。据图回答下列问题：

（1）该团队在将L1-GFP融合基因插入质粒P0时，使用了两种限制酶，据图推断它们是____。使用这两种酶进行酶切是为了保证 ____，也是为了保证____的正确连接。
（2）若观察到了____，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了表达的过程。
（3）为获得含有L1-GFP融合基因的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的____植入牛的____中，再进行体外培养、胚胎移植等相关操作。
（4）可采用胚胎分割移植技术一次获得多头表型相同的转基因牛，在对处于囊胚阶段的胚胎进行分割时，应注意将____。
（5）为检测L1-GFP融合基因是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定。在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的____（填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”）作为PCR模板。

【推荐2】瑞典卡罗林渐卡医学院2012年10月8日宣布，将2012年诺贝尔生理学或医学奖授予英国剑桥大学的约输·格登和日本医学教授山中伸弥，以表彰他们在“体细胞重编程技术”领域作出的革命性贡献。
（1）长期以来，人们一直认为人体干细胞是自不成熟的细胞发展成为专门的成熟细胞进行单向分化的，其生长过程呈现不可逆转的特点，然而格登教授发现，成熟的、专门的细胞是可以进行重新编程成为______________的，并进而发育成人体的所有组织，这一过程与植物的组织培养过程中的___________________________阶段非常相似。
（2）格登在1962年进行了一个实验一一把蝌蚪已分化细胞的核移植到卵母细胞的细胞质当中，经培育发育成了成体的青蛙，格登的这项实验首次证实，即使是已经分化的细胞，其基因组也是可以进行__的；这一过程还表现出了细胞核的______________具有划时代的意义，在这一实验过程中最基本的技术手段是______________。
（3）同为剑桥大学的教授英国生理学家罗伯特·爱德华兹，被誉为“试管婴儿之父”，他带领其研究团队，找到了3名健康志愿者(包括两名女性和一名男性)，去掉女性甲的次级卵母细胞的细胞核，然后将女性乙的次级卵母细胞的细胞核取出与这个去核细胞组成一个新细胞，再用这个重组细胞与男子的精子进行体外融合，形成一个受精卵，并且让它发育成一个早期的人类胚胎，如果研究继续做下去，把这个胚胎发育成一个真正的婴儿，你认为还需要____________________________。就是说与这个孩子的遗传、发育直接相关的亲代有_____________个。______________女人是这个孩子真正意义上的母亲，理由是____________________________。但是后来科学家团队当着法官，社会工作者和其他科学家的面处死了这个胚胎，并且向全世界宣布，不会让这个胚胎成为一个真正的人类个体，你觉得科学家的理由是____________________________。

【推荐3】科学家研究发现绒山羊的羊绒质量与毛角蛋白Ⅱ型中间丝基因（KIFⅡ）密切相关，获得转KIFⅡ基因的高绒质绒山羊的流程如图1所示。图2表示KIFⅡ基因与pZHZ1质粒构建重组质粒的过程，A、B、C、D为四种识别切割序列完全不同的限制酶的酶切位点。已知质粒pZHZ1的长度为3.7 kb（1 kb＝1 000对碱基），其中A~B区域长度为0.8 kb，B~C区域长度为0.2 kb，C~D区域长度为0.5 kb。请回答下列问题:

(1)图1中构建的重组表达载体，目的基因的上游应有____，它是____酶识别和结合的部位，驱动基因的转录。
(2)在图1过程③中，用____激素处理以获取更多的卵（母）细胞，这些卵（母）细胞需在体外培养到____期，方可进行过程④的操作。
(3)图1中过程④采用的生物技术是____，得到的重组细胞发育为早期胚胎后，可通过____技术获得较多胚胎。
(4)现分别用限制酶A、D切割图2中重组质粒pZHZ2样品，结果被酶A切割成1.7 kb和3.4 kb两个片段，被酶D切割成1.9 kb和3.2 kb两个片段。据此判断KIFⅡ基因的大小为____，并请将目的基因内部的酶D切割位点用相应的字母（D）标注在图3中_____。

【推荐1】某患者因血尿入院检查，医生诊断为肾小球性血尿，患者遗传系谱如图1。
（1）据图1分析，Ⅱ-2所患疾病的遗传方式是_________。若Ⅰ-1和Ⅰ-2生育第三个孩子，则患病概率为_________。
（2）经检查，Ⅱ-2视力和听觉也出现广泛受损，经诊断为Alport综合征（简称AS）。AS的发病与Ⅳ型胶原蛋白基因突变有关，这种胶原蛋白广泛分布于机体各组织，构成组织基底膜。研究者进一步对Ⅰ-1和Ⅱ-2编码Ⅳ型胶原蛋白的基因进行测序，结果如图2所示。

①Ⅳ型胶原蛋白的突变基因中，有三十余种基因突变都会导致该蛋白不同程度失效，这些基因突变的出现是由于基因突变具有_________性。与正常人的碱基序列相比较，Ⅱ-2的基因突变是由_________引起的。
②Ⅱ-2的患病较重，而父亲（Ⅰ-1）仅有轻度血尿症状，视力和听觉正常。从测序结果分析，Ⅰ-1体内肾脏细胞和皮肤、毛囊细胞中编码Ⅳ型胶原的基因序列_________（填写“相同”或“不同”）。那么，Ⅰ-1仅有轻度血尿症状的可能原因是_________。
（3）随着现代医学发展，该病患者经对症治疗可较好地控制病情。若Ⅲ-2和一个健康男性婚配后，希望生育不携带致病基因的后代，医生可对用于人工受精的卵子（编号①~④号）形成过程释放的极体中致病基因位点进行遗传检测（不考虑交叉互换），结果如下表。

编号	①	②	③	④
遗传信息-	-GATTGGTTATT-     -CTAACCAATAA-	-GATTGGTTATT-   -CTAACAAATAA-	-GATTGTTTATT- -CTAACCAATAA-	-GATTGTTTATT-   -CTAACAAATAA-
来源	第二极体	第二极体	第一极体	第一极体
正常基因模板链：- -GATTGGTTATT-

依据表中结果，医生应选择编号为_________的卵进行人工受精，得到的受精卵发育为早期胚胎后移植到Ⅲ-2子宫内，可实现生育不携带致病基因后代的目的。请依据减数分裂的知识，解释医生这样选择的依据：_________。
（4）该项技术可以有效保证遗传病患者或者遗传病致病基因携带者家庭生育不含致病基因的后代，大幅降低家庭和社会的养育成本。有同学认为可以通过基因编辑技术将人群中某种遗传病的致病基因均改造为正常基因，杜绝该种遗传病的发生。你认为这位同学的观点是否合理？请陈述理由：_________。

【推荐3】我国研究人员在世界上率先利用去甲基化酶（Kd4d）的mRNA，经体细胞核移植技术培育出第一批灵长类动物——食蟹猴，流程如图所示，①~⑥表示过程，该动物可作为研究癌症等人类疾病的动物模型。请据图分析回答：

(1)获得食蟹猴的体细胞核移植技术难度明显高于胚胎细胞核移植，原因是___。
(2)进行过程①时，细胞培养的培养液成分与植物组织培养基成分最主要的区别在于前者含有___，且在进行细胞原代培养时会出现___现象。
(3)动物细胞核移植技术中普遍使用的去核方法是___。图中过程⑤用到胚胎移植技术，其实质是早期胚胎在___条件下空间位置的转移。除图中所示外，胚胎移植技术中胚胎的来源还有___（答出两点）。
(4)科研人员发现对于灵长类动物的体细胞来说，单靠核移植本身并不足以使重构胚顺利发育成存活个体，还需要对供体细胞核进行表观遗传修饰才能开启细胞核的全能性。研究表明染色体组蛋白动态可逆地被修饰酶所改变，控制着基因的表达（如图所示）。

①据图分析，___组蛋白乙酰化水平和___组蛋白去甲基化水平有利于相关基因恢复表达，开启细胞核全能性，从而显著提高重构胚的发育率。括号内应填入的选项是___。
A.提高；提高   B.降低；降低
C.提高；降低   D.降低；提高
②科研人员通过设计实验验证以上观点。供选择试剂为：组蛋白去甲基化酶的mRNA、组蛋白甲基化酶的mRNA、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、生理盐水。
实验思路：将重构胚均分为甲、乙、丙、丁四组，分别注入等量的组蛋白去乙酰化酶抑制剂、___、___、等量生理盐水。一段时间后分别检测各组的胚胎发育率。
实验结果：各组的胚胎发育率丙组>甲组=乙组>丁组。