【推荐1】枯草芽孢杆菌所产生的透明质酸是一种应用广泛的粘性多糖，研究者欲改造枯草芽孢杆菌，通过添加诱导型启动子来协调菌体生长与产物生产之间的关系。
(1)图1中透明质酸合成酶基因H以a链为转录模板链，由此可以推测H基因的转录是从其______（填“左侧”或“右侧”）开始的。利用PCR扩增H基因时，设计适当的引物使H基因两侧分别添加相应的限制酶识别序列，则扩增______次才会得到8个等长的目的基因片段。
(2)为通过外源添加诱导剂来控制基因的表达，研究者选择了含木糖诱导型启动子的p质粒。p质粒位点1和2的识别序列所对应的酶分别是 Xho酶和BsaⅠ酶，目的是为了保证______，酶切后加入______酶使它们形成重组质粒。

(3)为协调菌体生长与产物生产之间的关系，将构建好的重组质粒转入经______处理后的枯草芽孢杆菌（D菌），在含______的培养基上筛选，得到枯草芽孢杆菌E（E菌）。对E菌进行工业培养时，培养基应先以蔗糖为唯一碳源，接种2小时后添加______，以诱导E菌产生更多的透明质酸。
(4)质粒在细菌细胞中遗传不稳定、易丢失，研究者尝试将重组质粒进行改造，利用同源区段互换的方法将H基因插入枯草芽孢杆菌D的基因组mpr位点，得到整合型枯草芽孢杆菌F（F菌）。请在图2方框中画出F菌的基因组______。

(5)对三种枯草芽孢杆菌进行培养，结果如图3。

经分析可知，______最适宜工业发酵生产透明质酸，理由包括______。
a. F菌比E菌生长迅速                  b. 透明质酸产量高
c. 培养基中不需要添加四环素        d. H基因整合到细菌DNA上，不易丢失

【推荐3】抗除草剂转基因作物的推广可有效减轻除草劳动强度、提高农业生产效率。图1为抗除草剂转基因玉米的技术流程。
   
(1)构建含除草剂抗性基因的表达载体，传统的方法是目的基因通过___________酶与载体进行重组。另外，可通过___________技术在目的基因两侧添加相应限制酶识别序列，以便构建表达载体。
(2)科研人员研发了新的DNA重组方法--无缝克隆In-Fusion技术，如图2所示。In-Fusion酶能够识别任何具有相同15bp末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，据此实现目的基因和载体的连接。和传统方法比，无缝克隆In-Fusion技术的优点是________________。

   
①应用以上方法构建含有A基因和GUS基因的重组DNA分子时，首先获得了图3中的3种DNA分子，然后混合进行In-Fusion反应。
   
如果引物2上额外添加的片段与GUS基因e片段（图中加粗表示）序列相同，那么引物1和引物4上额外增加的片段分别与载体中的片段（图中加粗表示）_____________、_____________相同。完成重组反应后，将表达载体导入农杆菌中。
②为筛选成功转入目标重组DNA分子的菌落，可以选取引物__________扩增目的基因并电泳检测。
(3)农杆菌转化愈伤组织时，常用含除草剂的选择培养基筛选转化的愈伤组织。由于愈伤组织表面常残留农杆菌，导致未成功转化的愈伤组织也可能在选择培养基上生长。针对上述现象，可以在选择培养基中同时加入_________进行筛选，其中周围的培养基___________（填“显”或“不显”）蓝色的愈伤组织是转化成功的，原因是___________。

【推荐1】β-胡萝卜素可在人体内转化为维生素A．普通水稻胚乳细胞中不含β-胡萝卜素，科研人员将psy基因（八氢番茄红素合成酶基因）和crtI基因（胡萝卜素脱饱和酶基因）转入水稻，培育出胚乳中富含β-胡萝卜素的水稻。为此研究者构建了含下图所示重组T-DNA片段的重组Ti质粒。
   
(1)据图分析，构建重组T-DNA片段时，科研人员首先要用限制酶_____和DNA连接酶处理，将psy基因和crtI基因接入，再用_____处理，将潮霉素抗性基因接入。将该T-DNA片段导入水稻细胞，获得T₀代植株。提取T₀代的总DNA，通过PCR技术检测_____。
(2)已知潮霉素对原核细胞和真核细胞的生长都有抑制作用，据此分析重组T-DNA片段中接入潮霉素抗性基因的作用是_____。
(3)重组T-DNA片段中有两种启动子，推测_____（填“启动子1”或“启动子2”）是水稻种子的胚乳细胞特异性表达的启动子，这样设计的目的是_____。
(4)据图分析，潮霉素抗性基因和psy基因转录时所使用的重组Ti质粒模板链_____（选填“相同”或“不同”），判断依据是_____。
(5)取T₀代水稻自交获得种子，种植后获得T₁代植株630株，表现出潮霉素抗性的植株有470株，据此可知转基因水稻与非转基因水稻的比约为_____，此性状的遗传遵循_____定律。
(6)综上可知，科研人员在_____水平上对转基因水稻进行检测与鉴定。

【推荐2】请回答下列与生物工程有关的生物学问题：
Ⅰ.下图为用两种不同方法制取乙肝疫苗的过程，请分析回答下列问题：

（1）图中A→B称之为__________技术，该技术的完成需要一种特定的酶，即______。
（2）目的基因产物是从该牛的乳汁中获取的，因而可将该牛称为__________，在构建基因表达载体时，所用的启动子必须来自于____________________。
（3）构建重组Ti质粒时，需将目的基因插入___________中，理由是_________________。
Ⅱ.生态经济主要是通过实行“__________”的原则，使一个系统产出的污染物，能够成为本系统或者另一个系统的生产原料，从而实现废弃物的资源化。“1＋1>2”所体现的是________原理。

【推荐3】甲型流感病毒是一种RNA病毒，包膜表面存在能与细胞膜表面受体结合的血凝素HA（蛋白质）。疫苗接种和病毒检测是流感防控工作的重要举措。请回答下列问题：
   
(1)可利用基因工程制备重组亚单位疫苗，其技术线路是：提取流感病毒RNA→通过RT-PCR（逆转录PCR）技术扩增筛选HA蛋白基因→构建基因表达载体→导入细胞并培养→提取并纯化HA蛋白→制成疫苗。
①利用RT-PCR技术，获取HA蛋白基因时，需加入____酶；据图甲分析，扩增HA蛋白基因时，应选择的引物为____。基因表达载体构建中为提高目的基因和运载体的正确连接效率，研究人员应在图甲中选择的限制酶是____。
②PCR的产物可通过电泳鉴定，设置如下：1号泳道为标准（Marker），2号泳道是以HA蛋白基因片段为材料做的阳性对照组，3号泳道为实验组。图丙中3号泳道出现杂带，原因一般有____（答出2点即可）。
(2)流感病毒核酸检测可用荧光定量RT-PCR技术，检测原理如图丁。当探针完整时，荧光基团（R）发出的荧光信号被淬灭基团（Q）吸收而不发荧光；当TaqDNA聚合酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q，使R发出的荧光信号并被相应仪器检测到，荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步。
①加入PCR体系中的探针的设计依据是____。
②利用荧光定量PCR仪可监测待测样液中病毒的核酸数量。若每断裂一个TagMan探针，设置R发出的荧光信号的值为1。若经n次的PCR扩增，实时荧光信号强度____（填“增强”“减弱”或“不变”），说明样液中病毒的核酸数量为0。

【推荐1】变异链球菌在牙面的粘附、集聚是龋齿发生的先决条件，转基因可食防龋疫苗是通过基因工程技术，将变异链球菌中与龋齿发生密切相关的抗原基因（PAcA基因）转入植物的表达载体中，利用植物生物反应器生产的可食用基因工程疫苗。
（1）转基因植物的制备：
单一使用PAcA基因，机体免疫应答不理想，霍乱毒素中有增强机体免疫应答的氨基酸序列（CTB），将CTB基因与PAcA基因连接成嵌合（PAcA-CTB）基因，作为_______与Ti质粒的T-DNA拼接，并用_______法导入离体的黄瓜叶肉细胞中，经植物组织培养获得转基因植株。
（2）转基因植株目的基因的PCR鉴定：已知PAcA-CTB基因部分序列如下
5’---CCGTGT…………ATGCCT---3’
3’---GGCACA…………TACGGA---5’
根据上述序列选择引物__________（填字母）进行PCR。
A. 引物：5′-GGCACA-3′                    
B. 引物：5′-AGGCAT-3′   
C. 引物：5′-CCGUGU-3′                    
D. 引物：5′-CCGTGT-3′   
反应结束后，电泳检测PCR产物，结果如图（1来自未转化植株，2是含PAcA-CTB基因的质粒，3-10来自转基因植物），从结果可以看出，__________号植物含有PAcA-CTB基因。

（3）对上述含PAcA-CTB基因的植株进一步研究，发现其中一些植株体细胞中含两个PAcA-CTB基因（用字母A表示，基因间无累加效应）。为了确定这两个基因与染色体的位置关系，研究人员单独种植每株黄瓜，将同一植株上雄花花粉授到雌花柱头上，通过子一代表现型及其分离比进行分析：
①若F₁中疫苗植株∶非疫苗植株=__________，则PAcA-CTB基因位于非同源染色体上，基因与染色体的位置关系如图甲所示。

②若F₁中疫苗植株∶非疫苗植株=3∶1，则两个基因位于__________，请在图乙中标出基因。③若F₁全为疫苗植株，则两个基因位于__________，请在图丙中标出基因。
（4）上述三种基因与染色体的位置关系适于进行推广种植的是两个基因位于__________的植株。多年后，在子代中出现了非疫苗植株，请推测三种可能的原因。

【推荐2】为使水稻获得抗除草剂性状，科研人员将除草剂草甘膦抗性基因转入水稻植株，获得抗草甘膦转基因水稻。

注：GUS基因表达产物经染色能从无色变成蓝色
（1）将草甘膦抗性基因作为________，与Ti质粒用相同的______和DNA连接酶处理构建基因表达载体。
（2）用___________________处理农杆菌后获得感受态细胞，将其与基因表达载体混合完成转化后，在添加_________________的培养基中，经筛选1得到含基因表达载体的农杆菌。
（3）取某品种水稻的幼胚，先进行__________处理，然后接种到培养基中，水稻幼胚细胞发生_____________________形成愈伤组织。用含基因表达载体的农杆菌侵染该愈伤组织。
（4）除了鉴定愈伤组织中是否含有目的基因以外，还可以利用GUS基因表达产物的鉴定进行图中的筛选2，以确定目的基因是否______。两次筛选后得到的转基因愈伤组织经过细胞的_____________过程，获得转基因水稻。
（5）为获得具有抗除草剂性状的转基因水稻，还需要在个体水平进行抗性测试。请你设计一个实验方案，筛选出对草甘膦具有抗性的转基因水稻。____________

【推荐3】现代基因编辑CRISP／Cas9技术可以对生物的DNA序列进行定点切割。将编码Cas9酶和sgRNA的基因作为外源基因构建基因表达载体后，导入受体细胞，可将细胞内某个基因定向敲除，其作用机理如下图所示。请回答问题。

（1）sgRNA与Cas9酶是一个功能复合体。如图所示，sgRNA有引导作用，与A基因中部分序列碱基互补配对，Cas9酶在配对区域定点切割，导致A基因发生碱基对_________，基因丧失功能。sgRNA与Cas9酶的联合作用类似于_________酶的作用。如果要获得基因敲除动物个体，应以_________作为受体细胞，用_________法导入CRISP／Cas9基因表达载体。
（2）研究人员担心基因编辑发生“脱靶效应”，导致其他非目标基因发生突变，我国科学家对此进行了检测。在小鼠受精卵分裂为两个细胞时，向其中一个细胞注入基因编辑工具，之后将此胚胎移植入母鼠子宫，待其发育到14.5天时，将胚胎取出，把胚胎的细胞全部分散开，分成基因编辑细胞后代和非基因编辑细胞后代两个细胞群，分别提取DNA，测序、比对。结果发现CRISP／Cas9技术的脱靶率很低，而另一类单碱基突变系统的基因编辑技术脱靶率极高。
①用同一受精卵分裂形成的两个细胞作为处理对象和对照，优点是________。
②利用二细胞胚胎分裂产生的子细胞DNA作为测序对象，而不是将实验组细胞和对照组细胞DNA进行PCR扩增后测序，原因是____________________________________。
③为方便将基因编辑细胞后代和非基因编辑细胞后代分开，可在构建基因表达载体时_____________________________________________。
④将胚胎细胞分散开需要利用_________酶的作用。
⑤上述研究除了利用基因编辑技术之外，还利用了多项胚胎工程技术，请写出其中两项技术名称__________________。
（3）基因编辑的“脱靶效应”可能对被编辑个体带来什么不良影响?__________________

【推荐1】生物工程
正常细胞不能合成干扰素，但含有干扰素基因。我国科学家禾用基因工程技术生产干扰素a﹣2b已实现量产。具体做法是将产生干扰素的人白细胞的mRNA分离，反转录得到干扰素基因。将含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的质粒pBR322和干扰素基因进行双酶切，再连接。将重组载体DNA分子在一定条件下导入大肠杆菌，在培养基中筛选培养，检测干扰素的表达量，选出高效表达的工程菌。请回答：
(1)在分化诱导因子作用下，正常细胞可以摆脱抑制、合成干扰素，在该过程发生的变化有　。

A．DNA的复制

B．转录

C．逆转录

D．翻译

(2)上述信息中提到的干扰素基因是基因工程中的　。

A．标记基因

B．目的基因

C．受体细胞

D．运载体

(3)质粒pBR322上的四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因在基因工程中有特殊作用，下列有关运载体上的这些特殊基因的描述正确的是___。
①运载体上可以没有这些特殊基因②受体细胞中也要有这些特殊基因③这些特殊基因不能损伤受体细胞的正常代谢活动
④这些特殊基因成功表达，就意味着得到了基因工科产品
(4)图中所有酶切产生的末端都不相同，根据材料和下图分析，构建重组载体DNA分时，酶的最佳选择是 。

A．酶A和酶B	B．酶A和酶C
C．酶B和酶C	D．酶A、酶B和酶C

(5)关于上题中酶的选择，下列说法合理的是　。

A．需要使用两种酶才能从含干扰素基因的DNA分子中分离出干扰素基因

B．使用双酶切的方法能保证目的基因和质粒进行定向连接

C．如果使用了酶A，将无法区分成功导入了重组质粒和导入不成功的受体细胞

D．使用双酶切的方法还能减少干扰素基因和质粒pBR322的自身环化

(6)下列关于“筛选含干扰素基因的受体细胞”的描述，正确的是____。
①先用含氨苄青霉素的培养基培养，再用含四环素的培养基培养
②先用含四环素的培养基上培养，再用含氨苄青霉素的培养基培养
③用既含氨苄青霉素也含四环素的培养基培养
④用既不含氨苄青霉素也不含四环素的培养基培养

【推荐2】请根据资料回答问题：
资料1：人体器官移植最大的难题是免疫排斥。猪细胞表面有一些人体没有的抗原，如α-1，3半乳糖苷转移酶就是其中的一种，因此人体会对移植的猪器官产生免疫排斥反应。
资料2:可利用基因打靶技术对猪细胞α-l，3半乳糖苷转移酶基因进行改造，去除α-l，3半乳糖苷转移酶引起的免疫排斥，主要过程如下：

第一步：从猪囊胚中分离出胚胎干细胞（野生ES)。需要改造的基因称为“靶基因”。
第二步：在含有一段与靶基因同源的序列上，插入新霉素抗性基因（neo)完成打靶载体的构建。
第三步：打靶载体导入胚胎干细胞，与含有同源序列的DNA分子重新组合，发生置换，形成突变ES细胞基因。
第四步：突变ES细胞筛选、增殖。
（1）资料2基因改造过程中，“靶基因”是________，打靶载体的构建过程相当于基因工程基本操作步骤中的__________。插入新霉素抗性基因后，“靶基因”不能表达的原因是_________，插入的新霉素抗性基因作为标记基因起到___________作用。
（2）利用克隆技术，使突变ES细胞增殖、分化，培育出不合成α—1，3半乳糖苷转移酶的猪器官，该过程体现了胚胎干细胞在功能上具有__________。但得到的器官还不能直接移植入人体，原因是_______。
（3）基因打靶技术给人体移植器官短缺难题的解决带来了可能。据图可知，该项技术能精准定位进行基因改造是由于_____________。

【推荐3】为增加油菜种子的含油量，研究人员从陆地棉中获取酶D基因，从拟南芥基因文库中获取转运肽基因：

（1）要获得酶D基因和转运肽基因A、D端相连的融合基因，首先需要用________酶和________酶处理可得到。
（2）将上述融合基因插入如图所示_________的T-DNA中，构建基因表达载体并导入农杆菌中，构建基因表达载体的目的是_______________________________________。
（3）携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，在细胞中进行___________，或_________，随染色体DNA进行同步复制。
（4）要检测转基因油菜中是否插入了融合基因，可以用_____________________作探针，使探针与_______________杂交，如果显示出__________，就说明融合基因已插入成功。