25. 金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在于动植物中具有金属结合能力的蛋白质,决定该蛋白质合成的基因结构如图1所示,其中A链为编码链、B链为模板链。科研人员利用图2所示质粒构建枣树的MT基因重组DNA分子并导入大肠杆菌细胞,获得对重金属镉(Cd)具有吸附能力和耐受能力的MT工程菌。
(注:XhoI、KpnI、PstI为不同限制酶的识别位点:LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以催化无色物质X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色,否则菌落为白色;amp
r基因为氨苄青霉素抗性基因。)
回答下列问题:
(1)获取目的基因
提取枣树细胞的
______,经逆转录获得cDNA:为了使PCR扩增后的产物按照正确的方向与已被酶切的载体连接,克隆MT基因时应选择的引物组合是
______,并在其
______(填“5
'”或“3
'”)末端分别添加限制酶
______的识别序列。
(2)构建重组DNA分子
①启动子是
______识别并结合的部位;基因工程中构建用于原核生物的表达载体时,常用的启动子不包括以下哪一项?
______(A.噬菌体基因启动子B.乳酸菌基因启动子C.大肠杆菌基因启动子D.枣树MT基因启动子)
②影响DNA连接反应的主要因素除pH与温度等操作环境、反应时间、DNA连接酶的种类及浓度外,还有
______等(答出1项即可)。
(3)导入、筛选和鉴定MT工程菌
①将得到的混合物导入到用
______处理的大肠杆菌完成
______实验。
②将菌液稀释并涂布在含X-gal和氨苄青霉素的培养基上进行培养后,随机挑取
______的单菌落可获得MT工程菌。
③欲进一步对MT工程菌进行鉴定,可将挑取出的MT工程菌与
______分别接种至含
______的LB液体培养基中,置于恒温培养箱中培养,适宜时间后检测菌种数量。
(4)扩大菌种
将MT工程菌接种至发酵罐内进行扩增,培养过程中可定期取样并使用细菌计数板对
______(填“菌体”或“菌落”)进行直接计数,以评估增殖情况。发酵结束后,采用
______(答出1项即可)等方法获得所需的发酵产品。