22. 采用IRES序列连接AFP基因(甲胎蛋白基因)和IL-2基因(白细胞介素-2基因)构建双基因共表达重组载体,能够利用同一载体同时表达出人甲胎蛋白以及人白细胞介素-2。该重组载体可用于肝癌的基因免疫治疗,既能发挥细胞因子的免疫调节作用,又能靶向性地针对肝癌产生特异性抗肿瘤效应。下图为双基因共表达重组载体的结构示意图。回答下列问题:
(1)从肝癌HepG
2细胞中获取mRNA并逆转录成cDNA作为模板,用含有BglⅡ和EcoRI酶切位点序列的AFP特异性引物进行PCR扩增,得到含有BglⅡ和EcoRI酶切位点的AFP基因片段。
①AFP基因PCR反应体系中需要加入模板、酶、引物和维持pH稳定的
____,还需加入
____以激活耐高温DNA聚合酶的活性。
②将限制酶BglⅡ、EcoRI的识别序列接在AFP引物的5'端,原因是
____,上游引物与下游引物四种碱基的碱基比相当,若上游引物核苷酸数目较多时,这一差异会直接影响PCR中的
____步骤。
(2)用限制酶BglⅡ、EcoRI分别酶切PIRES
2-EGFP质粒得到AFP基因片段,并使用T
4DNA连接酶进行连接,得到PIRES
2-AFP-EGFP重组载体;从CIK细胞获取cDNA作为模板,用含有BstXI和NotI酶切黏性末端的IL-2特异性引物进行PCR扩增,得到的IL-2基因与酶切后PIRES
2-AFP-EGFP重组载体混合,得到PIRES
2-AFP-IL-2重组载体。上述表达载体的构建过程中,获取目的基因及切割质粒均使用两种限制酶的目的是
____ 。
(3)IRES是mRNA5'端具有的一段较短的RNA序列,这类RNA序列能折叠成类似于起始tRNA的结构,从而介导核糖体与RNA结合,开启蛋白质翻译过程。与两个基因直接连接形成融合基因相比,两个基因之间插入IRES序列的意义是
____。
(4)人的AFP基因和IL-2基因能在奶牛膀胱上皮细胞中表达的原因是
____。