【推荐1】人体内的t-PA蛋白能高效降解血栓，是心梗和脑血栓的急救药。然而，为心梗患者注射大剂量的基因工程t-PA会诱发颅内出血。研究证实，将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血副作用。据此，先对天然的t-PA基因进行序列改造，然后再采取传统的基因工程方法表达该突变基因，可制造出性能优异的t-PA突变蛋白。下图是通过重叠延伸 PCR技术获取t-PA改良基因和利用质粒pCLY11构建含t-PA改良基因的重组质粒示意图（图中重叠延伸PCR过程中引物a，b用来扩增突变位点的上游DNA序列，引物c、d用来扩增突变位点的下游DNA序列）。请回答下列问题。

(1)科学家将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，生产出性能优良的t-PA突变蛋白的生物技术手段属于____________范畴。该工程的基础是________________________。
(2)获得性能优良的t-PA突变蛋白的正确顺序是____________（选择正确编号并排序）。
①t-PA蛋白功能分析和结构设计②借助定点突变改造t-PA基因序列③检验t-PA蛋白的结构和功能④设计t-PA蛋白氨基酸序列和基因序列⑤利用工程菌发酵合成t-PA蛋白
(3)已知t-PA蛋白第84位是半胱氨酸，相应的基因模板链（图中t-PA基因的上链）上的碱基序列是ACA，丝氨酸的密码子是UCU。重叠延伸 PCR示意图中的黑点便是突变部位的碱基，引物b中该突变位点的碱基是____________，引物c中该突变位点的碱基是____________。
(4)据图可知，PCR3时，需要的引物是__________________，引物的作用是__________________。若扩增图中序列时引物选择正确，PCR操作过程没有问题，但对产物进行电泳时，发现除了目标序列外还有很多非特异性条带，请分析出现此情况的原因__________________。
(5)若获得的t-PA 突变基因如图所示，那么质粒pCLY11需用限制酶____________切开，才能与t-PA突变基因高效连接。

【推荐2】自然界中的两种微生物，可以通过各自不同的作用将培养液中的葡萄糖转化为维生素C，其过程如图所示．在欧文氏菌中无2，5-DKG还原酶基因，不能将2，5-DKG转化为2-KLG．科学家通过基因工程技术，改造欧文氏菌，使其可产生2-KLG．请回答下列问题．

(1)改造欧文氏菌的过程中，目的基因为_____。将棒状杆菌的DNA全部提取出来，用适当的限制性核酸内切酶将其切成DNA片段，并导入受体菌的群体中，构成_____文库
(2)按其来源不同，改造过程中所使用的DNA连接酶有两类，即___DNA连接酶和___DNA连接酶。
(3)利用基因工程技术改造此细菌的基本方法是：先用____切割目的基因和______，然后用DNA连接酶将上述切割产物连接，构成_____并将其导入受体菌中。
(4)一般情况下，不能直接用未处理的此菌作为受体菌，原因是_______。

【推荐3】抗凝血酶Ⅲ是一种药用蛋白，对预防和治疗静脉血栓、心肌梗死、脑血管病变具有重要作用。为了提高抗凝血酶Ⅲ的产量，科研人员设计利用崂山奶山羊乳腺生物反应器制备抗凝血酶Ⅲ，并获得了成功。制作崂山奶山羊乳腺生物反应器的流程如图1所示。回答下列问题：

(1)获取了抗凝血酶Ⅲ基因后，需要通过PCR技术对该基因进行扩增，扩增的原理是____，扩增抗凝血酶Ⅲ基因的过程中一般不需要使用解旋酶，原因是____。
(2)图1过程③在基因工程操作步骤中属于____，切割质粒DNA的工具酶是____，能将特定部位的两个核苷酸之间的____断开。操作工程中需要将抗凝血酶Ⅲ基因插入到启动子与____之间，其中启动子的作用是____。
(3)获取重组质粒后，将重组质粒导入受精卵。从崂山奶山羊A的卵巢中获取卵子和从崂山奶山羊B的睾丸中获取精子，其中精子要进行____处理才具备受精的能力。图1中步骤④常用的方法是____。

【推荐1】幽门螺杆菌（Hp）属于一类致癌物，Hp与胃炎、消化性溃疡和胃癌等多种疾病有关。Hp的Ipp20基因能合成其特有的Ipp20蛋白质，科研人员据此利用基因工程制备Hp疫苗，该过程所选择的质粒及操作步骤如图所示。回答下列问题：
   
(1)通过PCR扩增Ipp20基因的反应需要在________溶液中进行，扩增Ipp20基因时的基本条件包括DNA模板、原料、Taq DNA聚合酶、_____等。
(2)在PCR反应体系中一般需要加入Mg²⁺，原因是________。科研人员探究了不同浓度的Mg²⁺对PCR扩增效果的影响，结果如表所示。科研人员认为PCR反应高效进行，Mg²⁺浓度并不是越高越好，据表分析，依据是________。

Mg2+浓度/(mmol·L-1)	0	2	3	4	5	6
Ipp20基因相对含量	-	＋	＋＋	＋＋＋＋＋	＋＋＋＋

注：“一”表示未检测到基因.“＋”表示检测到Ipp20基因，且“＋”越多，检测到的含量越多。
(3)已知在构建基因表达载体时使用了限制酶XhoI和XbaI切割质粒和Ipp20基因。科研人员采用了影印法筛选含有________基因的大肠杆菌，即使用无菌的线毡布压在培养基A（添加潮霉素）的菌落上，带出少许菌种，平移并压在培养基B（添加氯霉素）上。根据图示结果分析，含有________基因的大肠杆菌应从培养基_______中获取，理由是_______，且符合要求的大肠杆菌菌落是______（填培养基中数字）。

【推荐2】镰刀形细胞贫血症是一种单基因遗传病，是由正常的血红蛋白基因（HbA)突变为镰刀形细胞贫血症基因（Hbs)引起的。在非洲地区黑人中有4%的人是该病患者，会在成年之前死亡，有32%的人是携带者，不发病但血液中有部分红细胞是镰刀形。
（1）某表现型正常的非洲裔夫妇，若他们的孩子已经出生，检查孩子是否患病的方法是___________；若孩子尚未出生，可以来用从羊水中收集少量胎儿的细胞，提取出DNA，用___________技术进行复制，然后通过___________的方法确认胎儿是否正常。

（2）上图甲是正常人和患者血红蛋白基因的部分片段，若用Mst II限制酶切割下图中正常红细胞基因片段，则会出现_____________个相同的黏性末端。
（3）若用Mst II限制酶切割胎儿DMA后，用凝胶电泳分离酶切片段，片段越大，在凝胶带上距离加样孔越近。加热使酶切片段解旋后，用荧光标记的CFGACTCCT序列与其杂交，荧光出现的位置可能有下图乙所示的三种结果。若出现_____________结果，则说明胎儿患病；若出现_________结果，则说明胎儿是携带者。

【推荐3】近日，我国首次利用转基因猪的唾液腺作为生物反应器，高效合成一种对人的神经性疾病具有良好治疗作用的蛋白质——人神经生长因子（其对应的基因为hNGF基因）。该研究为生产高活性的人类药用蛋白提供了一种高效的新技术，拓展了畜牧动物在人类医学中的应用，给人类健康带来了新的福音。请回答下列相关问题：
(1)为获得大量的hNGF基因，科研人员利用PCR技术进行了扩增，该技术又称为__________反应，该过程中需要设计两种引物，这两种引物之间应最好具备什么条件?__________。
(2)科研人员将获得的hNGF基因（目的基因）与__________启动子结合在一起，然后将表达载体导入到__________（填“雄性”、“雌性”或“雄性或雌性”）受精卵中，利用__________技术获得囊胚，欲获得更多相同个体，可利用__________技术。
(3)与乳腺生物反应器相比，唾液腺生物反应器的优点是__________（答出两点即可）。

【推荐2】四尾栅藻生长周期短、适应性强，是一种高潜力生物柴油新型原料，但油脂产量低。研究人员从含油量高的紫苏中提取DGATl（催化油脂合成的关键酶）基因，并成功导入四尾栅藻细胞内，获得转基因的产油四尾栅藻。其制备流程如图，图中Amp^r表示氨苄青霉素抗性基因，LacZ基因可使细菌分解培养基中的物质X-gal，进而使菌落呈现蓝色，无该基因或该基因被破坏，菌落呈白色。回答下列问题：

(1)从高表达的紫苏组织细胞中提取总的RNA，经_________获得cDNA，用于PCR扩增，PCR扩增DGATl基因时，使反应体系中的模板cDNA解旋为单链的条件是__________________。
(2)在DNA延伸的过程中，使用Taq DNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是_____。
(3)构建的pMD19-DGATl导入经CaCl₂溶液处理的感受态大肠杆菌细胞中，并通过稀释涂布平板法接种到含_________的培养基中培养。一段时间后，挑选_________色的菌落以提取质粒pMD19-DGATl。
(4)用限制酶BamH I和Xba I切割pMD19-DGATl和pBI121，将其连接成重组表达载体pBI121-DGATl， 并将其导入四尾栅藻细胞中。与单酶切相比，双酶切的优点是________。

【推荐1】某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP，表达产物能发出绿色荧光）整合到野生型小鼠Gata3基因的一端，该过程未破坏Gata3基因，以此研究小鼠Gata3基因的表达情况，结果如图甲所示。回答下列问题：

   

(1)用图甲中重组的基因构建基因表达载体时，载体可以不需要额外的标记基因，原因是_____。若用质粒构建基因表达载体，则除了图甲中标出的结构，质粒还需要具备的结构有_____（答出2点）。
(2)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的_____，引物的作用是_____。构建重组质粒后，为了确定GFP是否成功整合到质粒中，需要进行PCR检测，若仅用一对引物，则最好选择图甲中的_____。
(3)科研人员实验培育得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，让这两只小鼠交配来获得Gata3—GFP基因纯合的小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，科研人员设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。图中个体_____（填数字）是Gata3—GFP基因纯合的小鼠。

   

【推荐2】α－抗胰蛋白酶是一种主要由肝细胞合成的血浆蛋白，具有维持内环境稳定的功能。科研人员利用乳腺生物反应器获得了α—抗胰蛋白酶。回答下列问题：
(1)将人正常干细胞系L－02培养在某动物细胞培养基中，在37℃、5％CO₂的培养箱中培养。待细胞培养至对数生长末期，用_________酶消化，进行细胞计数和离心收集，提取RNA，经____________（填过程）最终获得α—抗胰蛋白酶基因。
(2)利用PCR技术扩增α—抗胰蛋白酶基因时，科研人员在两个引物的______（填“5＇端”或“3＇端”）各添加一种限制酶的酶切位点。α—抗胰蛋白酶基因两端添加不同的限制酶切割位点的目的是____________________。
(3)将含基因表达载体的受精卵置于早期胚胎培养液中进行培养，早期胚胎进行移植前，需进行性别鉴定。性别鉴定的操作思路是__________________。
(4)转基因牛成年后需对其α—抗胰蛋白酶基因的表达产物进行检测，一般采用______法。

【推荐3】人血清白蛋白(HSA)具有重要的医用价值，只能从人血浆中制备。下图是以基因工程技术获取重组HSA(rHSA)的两条途径。

(1)为获取HSA基因，首先需采集人的血液，提取________合成总cDNA，然后以cDNA为模板，使用PCR技术扩增HSA基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。
______
(2)启动子通常具有物种及组织特异性，构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体，需要选择的启动子是________(填写字母，单选)。

A．人血细胞启动子

B．水稻胚乳细胞启动子

C．大肠杆菌启动子

D．农杆菌启动子

(3)构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA载体的过程中，用到的工具酶有限制酶和__________，其作用于__________键。
(4)人体合成的初始HSA多肽，需要经过膜系统加工形成正确空间结构才有活性。与途径Ⅱ相比，选择途径Ⅰ获取rHSA的优势是______________。
(5)为证明rHSA具有医用价值，须确认rHSA与___________的生物学功能一致。