【推荐1】去年年初，国内牛奶制品因为牧草进口成本上涨而涨价的现象引起了人们的关注。紫花苜蓿是一种重要的牧草，某研究团队拟将耐盐基因HLAl导入紫花苜蓿中培育耐盐牧草，具体实验流程如图甲，图乙是载体pCHLAl中T-DNA示意图。回答下列问题：

(1)过程②为________________，是基因工程的核心步骤，此过程需要使用的酶有________________。
(2)过程③常用的转化方法是农杆菌转化法，转化是________________。
(3)已知Basta是一种除草剂，则为达到培养并筛选的目的，过程④的培养基所含的成分必须含无机营养、有机营养、________________。
(4)过程④得到的幼苗________________（填“一定”或“一定不”或“不一定”）含有HLAl基因，为进一步确认，可用PCR扩增的方法进行鉴定，进行PCR反应所用到的引物应根据________________设计。
(5)要检测目的基因是否插入到苜蓿细胞的染色体DNA上，可采用___技术。
(6)判断本实验的目的基因是否表达成功，还应进行__________实验。

【推荐2】鲸死亡后会沉入海底，俗称“鲸落”。“鲸落”后期会形成一个以厌氧菌和硫细菌等为主体的生态系统。厌氧菌以“鲸落”肌肉中的脂肪为食，同时产生一些硫化氢等硫化物。硫细菌将硫化物氧化成硫酸盐，并以该过程中释放的能量合成有机物。请回答相关问题：
(1)培养微生物的培养基中一般都会含有水、无机盐、氮源和碳源，培养“鲸落”群落中厌氧菌的碳源是____。硫细菌属于____（填“自养或“异养”）生物，因此培养基中的成分需要特殊配制，主要体现在____,这种培养基可以用来专一性培养硫细菌，所以属于____培养基。
(2)科学家欲研究死鲸的遗传属性，在“鲸落”中提取到了死鲸的DNA,然后可以用____技术对其DNA进行扩增，在扩增死鲸DNA的过程中，除了要加入死鲸的DNA作模板外，还需要加入____（至少答三种）等物质。
(3)为了统计“鲸落”中含有微生物的数量，需将“鲸落”提取物加水稀释，然后将稀释水样用涂布器分别涂布到____（填物理状态）培养基进行培养后计数，这种方法称为____。下面所示的四种菌落分布情况中，不可能由该方法得到的是____。与实际活菌数相比，该方法的统计结果一般偏____，原因是____。
   

【推荐3】β1，3葡聚糖酶可以水解许多病原真菌细胞壁外层的β-1，3葡聚糖和几丁质，降解真菌细胞壁，从而抑制真菌的生长与繁殖。研究人员在植物中克隆到β-1，3葡聚糖酶基因（BG2）并转入苹果主栽品种，以减少苹果真菌病害、实现无公害生产。据图和所学知识回答下列问题：

(1)BG2的克隆可利用PCR技术，需要一小段能与该基因碱基序列互补配对的_____作为引物，BG2的克隆前，需准备_____种引物。两种引物序列不能互补的最可能原因是_____。
(2)上图为利用PATC940（经农杆菌Ti质粒改造获得）构建BG2抗病质粒的过程。图中右下处的酶为DNA连接酶，人工设计的复合启动子的作用是驱动转录和提高（增强）转录活性，它位于目的基因（BG2）的_____（填“上游”或“下游”）。用XbaI酶切、SpeI酶切、NotI酶切目的基因与PATC940的优点是构建基因表达载体时，可以防止_____、_____以及防止目的基因与质粒反向连接。
(3)中国科学家独创的一种方法，将Bt基因导入棉花细胞，这种方法是_____，例如，可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入_____中。研究人员将转入BG2抗病质粒的农杆菌与苹果外植体共培养，进行遗传转化。目的基因BG2将随着T-DNA转移到被侵染的细胞而进入细胞，并随其整合到该细胞的染色体DNA上。
(4)在完成遗传转化后，培养基中至少要加入两种抗生素，请推测其作用分别是：一种用于杀死农杆菌，另一种用于_____。这样的培养基在微生物学上称为_____。
(5)需要不断观察和检测转基因苹果植株在田间的生长状态，以确定目的基因是否赋予了苹果植株抗真菌特性以及_____，这属于_____水平的鉴定。

【推荐1】科研人员在某基因工程实验中使用的五种限制酶的识别序列和切割位点如下图所示，在使用的质粒上仅有限制酶SpeⅠ的识别序列，而目的基因的两端都有五种限制酶的识别序列，且目的基因内部有限制酶SpeⅠ的识别序列。回答下列问题：

(1)限制酶主要是从___________（填生物类型）中分离纯化出来的，根据限制酶的来源和作用推测，限制酶存在于该类生物中的主要作用是___________。
(2)质粒作为目的基因进入受体细胞的载体，需要具备___________等条件。该实验中构建基因表达载体时，质粒上限制酶SpeⅠ的识别序列应位于复制起点所在方向上的__________之间。
(3)切割目的基因时只能选取五种限制酶中的___________ （填限制酶）进行切割。质粒和目的基因连接完成后，该连接点___________（填“能”或“不能”）被这两种限制酶中的某一种酶切割。
(4)通过基因工程能够跨物种实现基因转移并成功表达的基础是___________（答出两点）。

【推荐2】虾青素可由β-胡萝卜素在β-胡萝卜素酮化酶（BKT）和β-胡萝卜素羟化酶（CRTR-B）的作用下转化而来，具有抗衰老、增强免疫、保护心血管等功能，杜氏盐藻是单细胞浮游植物，生长快，易培养，能大量合成β-胡萝卜素，科研人员将BKT基因和CRTR-B基因导入杜氏盐藻，构建杜氏盐藻细胞工厂高效生产虾青素。
(1)获取目的基因：雨生红球藻是天然虾青素重要来源，提取雨生红球藻的总DNA为模板，设计特异性引物扩增BKT基因和CRTR-B基因，此过程需要____________酶的催化。

   

(2)构建转化载体：“无缝克隆法”是构建重组质粒的新方法，指利用同源重组酶将末端具有一致同源序列的线性化载体和目的基因连接形成重组质粒，图1表示利用“无缝克隆法”向质粒中插入抗除草剂基因的基本过程。
Ⅰ．PCR获取抗除草剂基因过程中，为确保基因两端具有所需同源序列，需在引物的__________端添加对应的同源序列。若要确保抗除草剂基因能够从重组质粒中切除，还需要在基因两侧加入限制酶识别序列，则所需引物（5'-3'）的序列应为：_______。
A．同源序列+特异性扩增引物序列+限制酶识别序列
B．同源序列+限制酶识别序列+特异性扩增引物序列
C．特异性扩增引物序列+限制酶识别序列+同源序列
Ⅱ．科研人员利用“无缝克隆法”同时将BKT基因和CRTR-B基因插入质粒，形成的重组质粒对应部位如图2所示，推测此过程扩增BKT基因所用的引物为__________；扩增CRTR-B基因所用的引物为___________；
Ⅲ．最终形成的重组质粒如图3所示，其中atpA启动子和psbA启动子均为杜氏盐藻叶绿体启动子，选用内源性启动子的目的是_____________；
IV．与传统的酶切法构建重组质粒相比，“无缝克隆法”具备的优势有________（2分）
(3)目的基因导入及相关检测：采用基因枪法将重组质粒导入杜氏盐藻叶绿体，一段时间后，用含__________的培养基筛选已转化的杜氏盐藻，通过相关技术检测目的基因是否成功表达。
(4)叶绿体转化是植物基因工程的新热点，叶绿体的诸多特点为叶绿体转化提供优势，如叶绿体基因组小，功能清晰，使基因操作方便；叶绿体细胞具有自我复制功能，一个植物细胞可含有多个叶绿体，每个叶绿体中含有多个基因组，可大大提高_____________；另外，叶绿体基因位于细胞质中，可有效避免__________。

【推荐3】日常生活中产生的厨余垃圾含有大量有机物，极易腐败发酸发臭、滋生有害生物，若收集转运过程中发生泄漏则会污染空气、土壤及水源。科研人员从绿色木霉中获得了纤维素内切葡聚糖酶基因EGⅢ，并将其导入毕赤酵母中，构建出了基因工程菌（流程如图所示），实现了高效降解厨余垃圾中纤维素的目的。请据图回答下列问题。

   

注：图中BamHⅠ、ECoRⅠ、SalⅠ为限制酶
(1)限制酶能够识别__________，并且使每一条链中特定部位的__________断开。为了构建基因表达载体，应该选择__________（限制酶）切割目的基因和质粒DNA，判断的依据是__________。完整的基因表达载体包括__________。
(2)将目的基因导入大肠杆菌后，需在培养基上培养，培养基需用__________法进行灭菌，培养皿用__________法进行灭菌。
(3)毕赤酵母能够表达出纤维素内切葡聚糖酶，转化才算成功，请设计实验检验转化是否成功__________。

【推荐1】异丁醇具有燃值高、能量密度高等优点，其开发和利用对优化我国能源结构和保护环境有非常重要的战略意义。基于酿酒酵母的发酵途径（图甲）和图乙的质粒，研究者构建了一种表达载体pUC18，用于过表达ILV2、ILV5、ILV3、AR010基因，以实现异丁醇的大规模生产。已知氨苄青霉素能抑制细菌细胞壁的形成。据此回答下列问题：

(1)图乙质粒上有多个限制酶切位点，作用是____。研究人员先用pUC18转化经____处理（处理方法）的大肠杆菌，以便筛选、鉴定扩增重组质粒。重组质粒上有____，所以能在大肠杆菌中扩增。
(2)将环状载体pUC18导入酿酒酵母时，一般会将其进行酶切得到线性化载体，随后再将其导入受体细胞。根据所学的知识推测酶切得到线性化载体的目的是____。
(3)提取成功构建的表达载体并导入不能合成组氨酸的酿酒酵母菌株，将菌株接种在培养基中以获得单菌落，培养基中必须要添加的物质有____（用下列字母填写：a．组氨酸、b．氨苄青霉素、c琼脂）。
(4)异丁醇的大量积累会伤害细胞，研究人员给该工程菌导入一个经改造的光敏蛋白基因，使工程菌对特定的蓝光敏感。进行不同的光照处理，使其在异丁酵产生阶段和生长繁殖阶段进行切换，结果如下图丙所示。

注：5 / 10/ 20h pulse分别代表在黑暗条件下每隔5、10、20h发出15s和65s的蓝光脉冲30min
①对照组的酵母菌需要导入____。
②以葡萄糖为碳源，利用该转基因酿酒酵母进行发酵时，若想进一步提高其异丁醇产量，综合图甲和图乙信息，分别写出进一步优化菌株和工艺的措施____。

【推荐2】1型糖尿病是因免疫系统将自身胰岛素作为抗原识别而引起的自身免疫病。小肠黏膜长期少量吸收胰岛素抗原，能诱导免疫系统识别该抗原后应答减弱，从而缓解症状。科研人员利用1型糖尿病模型小鼠进行动物实验，使乳酸菌在小鼠肠道内持续产生人胰岛素抗原，为此构建重组表达载体，技术路线如下。据图回答：

(1)为使人胰岛素在乳酸菌中高效表达，需改造其编码序列。下图是改造前后人胰岛素B链编码序列的起始30个核苷酸序列。据图分析，转录形成的mRNA中，该段序列所对应的片段内存在碱基替换的密码子数有_____个。

(2)在人胰岛素A、B肽链编码序列间引入一段短肽编码序列，确保等比例表达A、B肽链。下列有关分析正确的是_____（多选）。

A．引入短肽编码序列不能含终止子序列

B．引入短肽编码序列不能含终止密码子编码序列

C．引入短肽不能改变A链氨基酸序列

D．引入短肽不能改变原人胰岛素抗原性

(3)在重组表达载体中，SacⅠ和XbaⅠ限制酶仅有图示的酶切位点。用这两种酶充分酶切重组表达载体，可形成_____种DNA片段。

【推荐3】回答下列（一）、（二）小题：
（一）为了提高果胶酶的利用率，科学家进行了固定化果胶酶的相关研究。
（1）果胶酶的固定化：取磁性壳聚糖微球固体颗粒，加入果胶酶溶液，30℃条件下振荡1h，装入下图所示的反应柱中，用蒸馏水洗去____________，放置在 4℃ 冰箱中 保存。上述固定化果胶酶的方法属于__________________。
A．包埋法        B．吸附法        C．共价偶联法       D．交联法

（2）果胶酶活力测定方法：以 1g 果胶酶单位时间内催化产生的主要产物_____________的量计算酶的活力。已知 3，5-二硝基水杨酸与果胶水解的主要产物共热能产生棕红色 的氨基化合物，在一定范围内产物的量和反应液颜色深浅成正比，可用_____________法测定产物的量。此方法需要制作标准曲线，如上图所示，其中纵坐标一般为_______________ 。
（3）下图是固定化果胶酶的部分研究结果，据图可知用上述方法制备的固定化果胶酶与游 离酶相比最适温度_______________（升高/降低）。

（4）在果汁生产中使用固定化果胶酶具有很多优点，以 下说法中不属于其优点的是____________
A．固定化果胶酶可以重复回收，多次利用
B．固定化果胶酶可以提高酶的稳定性和果汁的质量
C．便于果汁加工工艺操作的连续化、自动化
D．用于处理溃碎果实，可以提高出汁率，促进澄清
（二）某研究小组欲利用抗虫基因，通过农杆菌转化法培育抗虫玫瑰。图 1 和图 2 分别表示出了抗虫基因和农杆菌 Ti 质粒的限制性核酸内切酶的识别位点和抗生素抗性基因（PstⅠ、 SmaⅠ、AluⅠ表示限制性核酸内切酶切割位点；amp 为氨苄青霉素抗性基因，tet 为四环素 抗性基因）

请回答：       
（1）该抗虫基因取自某种生物的 cDNA 文库。若想短时间内得到大量的抗虫基因，需用到 ___________技术。
（2）形成重组质粒时，为保证目的基因以唯一方向接入，可选用_____________ （填限制酶 的种类）分别切割目的基因和 Ti 质粒，再用 _________连接，形成重组 DNA 分子， 再与经过_____处理的本身无 amp 和 tet 的农杆菌液混合，使重组 DNA 进入农杆 菌。导入了重组质粒的农杆菌能够在含有______________的培养基中生长。再利用 农杆菌转入培养的玫瑰细胞，使目的基因导入玫瑰细胞中。
（3）将含有导入了目的基因的玫瑰细胞的试管放在___________上，进行液体悬浮培养获得胚 性细胞，进而培育成抗虫玫瑰。这一技术利用的原理是 ____________。

【推荐1】镰刀菌、立枯丝核菌引起的水稻（2n=24）立枯病和褐飞虱引起的水稻虫害，常常造成水稻减产。某科研团队为培育抗褐飞虱、抗立枯病的水稻新品种，以对褐飞虱不具有抗性的连粳11号、龙粳39号、荃优822号三个纯合水稻品种为实验材料，进行了相关实验。回答下列问题：
(1)为建立水稻基因组数据库，科学家须完成水稻____条染色体的DNA测序。
(2)连粳11号对镰刀菌表现为易感病，对立枯丝核菌表现为抗病，而龙粳39号则相反。水稻对镰刀菌和立枯丝核菌的抗性分别受非同源染色体上的A/a、B/b基因控制。连粳11号和龙粳39号杂交得到F₁，F₁自交得到F₂，统计F₂结果如下图所示。据图可知，连粳11号和龙粳39号的基因型分别为____，F₂中对两种菌均具有抗性的个体占____。请简要写出简便获得对两种菌均具有抗性的纯合子（标记为甲）方案____。

(3)该团队利用X射线对荃优822号水稻进行处理后，发现少数水稻（标记为乙）对褐飞虱产生了较高抗性。其5号染色体上某DNA区段与高抗虫性相关，对荃优822号的该区段设计重叠引物，提取乙和荃优822号的5号染色体DNA进行扩增，扩增产物的电泳结果如下图所示：

据图推测5号染色体上第____对引物对应区间的基因（标记为N基因）发生了碱基的____（填“增添”、“缺失”或“替换”）。
(4)研究者对N基因进行分离和克隆，以其作为目的基因与Ti质粒的____进行拼接，并运用农杆菌转化的方法导入到水稻甲的叶肉细胞中，经____获得转基因植株（标记为丙），
(5)对丙进行扩大培养，发现有部分丙植株体细胞中含有2个N基因，让其自交后得到可以稳定遗传的抗褐飞虱新品种丁。请参照图例在作答区域内标出丁植株细胞内N基因在染色体上可能的相对位置____（圆圈表示细胞，竖线表示染色体，圆点表示基因位点，字母表示基因）。

【推荐2】研究发现人溶菌酶（hLZ）是天然抗生素替代品。科学家培育出转人溶菌酶基因山羊,以大规模生产人溶菌酶（从乳汁中提取）,过程如图所示。其中编号①~⑨表示过程；质粒S中的基因Leu通过控制相关酶的合成来影响亮氨酸的合成（亮氨酸是山羊细胞维持生命活动必不可少的一种氨基酸）,基因GFP控制合成绿色荧光蛋白。四种限制酶的识别序列及切割位点见下表。请回答下列问题:

限制酶	识别序列和切割位点
BamHI	-G↓GATCC-
BglII	-A↓GATCT-
HindⅢ	-A↓AGCTT-
XbaI	-T↓CTAGA-

(1)过程①通过PCR技术扩增物质A,需要的酶是_______;过程②需要的限制酶有_______;过程③需要的酶是限制酶和_______。
(2)为成功筛选出含重组质粒T的成纤维细胞,质粒S中用作标记基因的是_______和_______。为达到筛选目的,培养基的营养成分中应不含有_______。将成纤维细胞培养一段时间后观察,筛选出_______（填“显示”或“不显示”）绿色荧光的细胞用于过程⑤。
(3)过程④常用_______法,过程⑨为_______。图中早期胚胎的_______（填结构）将发育成转基因羊的各种组织。

【推荐3】养殖家禽的饲料中富含谷物，纤维素是谷物的重要成分，但家禽消化道中缺少能降解纤维素的酶，阻碍了家禽对饲料的吸收与利用。研究人员利用转基因技术改造乳酸杆菌，将其添加于饲料中，以提高家禽养殖效率。
（1）枯草芽孢杆菌分泌可降解纤维素的一种酶，这种酶由W基因编码。为在乳酸杆菌中表达W基因，需使用图1中质粒为载体。图2为克隆得到的含W基因的DNA片段，W基因以乙链为转录模板链，转录时mRNA自身延伸的方向为5'→3'。

①很多启动子具有物种特异性，在图1质粒中插入W基因，其上游启动子应选择___________（填正确选项前字母）。
A．枯草芽孢杆菌启动子B．乳酸杆菌启动子C．农杆菌启动子
②下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点。

限制酶	EcoR I	BamH I	Kpn I	Mfe I	Hind III
识别序列及切割位点

根据上述信息，应使用限制酶___________切割图1中质粒，使用限制酶___________切割图2中含W基因的DNA片段，以获得能正确表达W基因的重组质粒。所得重组质粒转化乳酸杆菌后，使用含抗生素_______的培养基筛选，以得到转入W基因的乳酸杆菌。
（2）为确定导入重组质粒的乳酸杆菌是否具有分解纤维素的能力，研究人员用液体培养基分别培养下表所示菌种。所得部分菌液接种于固体鉴定培养基上，另取部分菌液上清液测定酶活力，实验方案及测定结果如下表所示。

菌种	酶活性相对值
乳酸杆菌	未检出
X	未检出
导入了重组质粒的乳酸杆菌	0．96

表中的X应为___________。若要检测导入重组质粒的乳酸杆菌是否合成了纤维素酶的方法是_____________。
（3）解决谷物中纤维素难以被消化吸收的另一思路是将W基因转入家禽中，使转基因家禽消化道特异表达能够降解纤维素的酶。采用显微注射的方法将重组质粒导入_________细胞中，上述研究方法与该思路相比，有哪些优点_________________（写出2点）。