【推荐1】GFP是一种可以发出绿色荧光的蛋白质。GFP融合基因是将GFP基因与其它基因融合在一起。该技术使融合基因编码的蛋白质可以在细胞或组织中发出荧光，从而实现对基因表达的蛋白质的定位进行观察和研究。下图是目的基因和含GFP基因的载体的部分结构。科研人员欲将目的基因连接在图中的载体上，使得融合基因上的荧光蛋白基因得以表达。下图标记了目的基因和载体部分结构中限制酶切位点及相关限制酶识别序列和切割位点，回答下列问题。

(1)PCR扩增目的基因时，F、R表示扩增时所用的____，其是指____。作用是____。
(2)构建融合基因时，需要在R的____端加上____酶的识别序列，F的相应端加上____酶的识别序列，并用____酶对载体进行切割。
(3)PCR产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，DNA分子的迁移速率与____有关。
(4)将融合基因导入植物细胞常采用农杆菌转化法，转化是指____。

【推荐2】2020年初新型冠状病毒肆虐全球，生物医学工作者进行了专业应对，尤其是我国一大批医护人员和相关研究专家，做出了突出的贡献。研究发现新型冠状病毒可通过表面的棘突蛋白（S蛋白）与人呼吸道黏膜上皮细胞的ACE2受体结合，侵入人体，引起肺炎。请回答下列问题：
(1)采集、扩增：核酸检测样本多采集于咽、鼻。扩增前，需将收集到的样品进行逆转录处理以获得后续扩增过程的_____；除此之外，扩增过程中，需要向反应体系中加入_____以确保扩增产物的特异性。
(2)检测：近期某地区爆发新冠病毒传染，需进行全民多次检测。医务工作者为加快检测进度，将多人的样本采集后，放到同一根采样管中进行检测。如果检测结果为阳性，则说明：_____，为进一步确定感染者，医务工作者下一步要做的工作是：_____。
(3)研制抗体：研制抗S蛋白单克隆抗体，需先注射_____免疫小鼠以激活小鼠的免疫细胞。当杂交瘤细胞在体外条件下做大规模培养时，为防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害，应采取的措施是_____。新型冠状病毒化学发光检测试剂盒以单克隆抗体为主要“部件”，该试剂盒能快速准确地检测出病例是利用了单克隆抗体的_____等优点。
(4)生产灭活疫苗：灭活疫苗的制备需要经过细胞培养、病毒培养、灭活、纯化等步骤，细胞培养的目的是_____。细胞培养需要在二氧化碳培养箱中进行，二氧化碳的作用是_____。
(5)腺病毒载体重组疫苗：腺病毒载体重组疫苗和mRNA疫苗产生抗原的场所都是在_____（填“内环境”或“细胞内”）。与传统的减毒疫苗相比，腺病毒载体重组疫苗和mRNA疫苗等新型疫苗的安全性有所提高，是因为_____。
(6)突破性病例是指完成第二剂疫苗接种至少2周内，仍出现感染新冠病毒的病例。产生突破性病例可能的原因是_____。

【推荐3】玉米是世界上的第三大粮食作物，广泛种植于世界各地。研究表明，转基因抗虫玉米中的细菌BT基因能表达一种毒蛋白，这种毒蛋白能有效杀死玉米螟（一种农业害虫）。请回答下列问题：
（1）BT基因在基因工程中称为_________。在基因表达载体中，除了要有BT基因外，还必须有启动子、终止子和______，将BT基因导入玉米细胞常用_________法。
（2）利用PCR技术扩增BT基因时，需要提供模板、原料、______、引物等条件，将模板DNA加热至90〜95℃ 的目的是__________。
（3）BT基因与载体结合过程中需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶。若某限制酶的识别序列和切点是，请画出目的基因被限制酶切割后所形成的黏性末端_______。DNA连接酶对所连接的两端碱基序列__________(填“有”或“没有”）专一性要求，定性地检测BT基因的“表达”产物可采用_____的方法。
（4）为了防止抗虫玉米通过花粉传播带来的生态学问题，科研小组考虑将抗虫基因导入到玉米根尖细胞的__________中以防止基因污染，同时在大规模种植的抗虫玉米田中设置一个或多个避难所种植普通玉米，目的是_______________。

【推荐1】小鼠癌症模型是目前最为常用、先进和公认的临床前抗肿瘤药物效应评价体系， 该模型随着肿瘤治疗策略的革新而不断发展，并为癌症的治疗手段提供重要的理论及实践指导。下图表示利用小鼠胚胎干细胞(ES 细胞)做的小鼠癌症模型，据图分析回答下列问题：

（1）a 过程表示基因工程，则其核心步骤是_____，该过程的目的_______________。
（2）b 过程可增加 ES 细胞的数量，若想从早期胚胎中获得更多的 ES 细胞，可将早期胚胎培养至_______ (时)期。d 过程移入的胚胎能够存活，从免疫学上来说，是因为代孕子宫不会 对其发生____________反应。d 过程进行前，要对代孕小鼠进行_______________ 处理。 用肝癌细胞作抗原刺激 B 淋巴细胞，再将此淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后获得细胞代谢产物______________，该产物与抗癌药物结合制成“生物导弹”，从而定向杀死小鼠体内的肝癌细胞。
（3）早期胚胎发育过程中，细胞逐渐开始分化，形成将来发育成各种组织的_______ 和滋养 层细胞，这个时期的胚胎叫做_______ 。进一步扩大，会导致透明带破裂，胚胎从其中伸展 出来，这一过程称为_______ 。
（4）图示研究过程中使用的技术有_____________________________(至少答出 3 个)。

【推荐2】蜘蛛丝是自然界中机械性能最好的天然蛋白纤维，其强度高于制作防弹衣的凯夫拉纤维，有广泛的应用前景，但如何大量获取蜘蛛丝纤维的问题一直未解决。近期，中国科学家利用基因工程技术成功的在家蚕丝腺细胞中大量表达蜘蛛丝蛋白。

（1）在转基因过程中，若利用图所示质粒构建基因表达载体，需要用_____________酶来切割目的基因，该切割方法的优点是_____________________________________________
(答出一点即可)。
（2）为获取大量的蜘蛛丝基因，常采用_______________技术对该基因进行扩增。扩增蜘蛛丝基因前，需根据目的基因的核苷酸序列设计__________种引物。进行扩增时需先加热至90～95℃，加入引物后冷却至55~60℃，以上调控温度操作的目的是____________________。
（3）载体中的启动子是____________酶的识别结合位点，以便于驱动遗传信息的表达过程；而载体本身的扩增，需借助于载体上的_________________；载体上的标记基因的作用是_____________________________。
（4）研究人员发现若将蛛丝蛋白31号位的色氨酸替换为酪氨酸，蛛丝韧性可提高50％，这项成果用到的生物工程技术为____________________________。

【推荐3】科学家将编码牛凝乳酶的基因（长度1.5Kb）导入大肠杆菌获得工程菌，再通过工业发酵批量生产凝乳酶。右图1为所用载体示意图，图2为限制酶的识别序列及切割位点。请据图回答下列问题：

限制酶	Hind Ⅲ	Pvit2	Kpn I	EcoR I	Pst I	BamH I
识别序列	A↓AGCTT	CAG↓ CTG	G↓GTACC	G↓AATTC	CTGC↓AG	G↓GATCC

                                                                                                         图2
(1)获取牛凝乳酶基因：提取小牛胃黏膜组织中的____，经逆转录得到____，将其作为PCR反应的模板，设计一对特异性引物来扩增目的基因。
(2)构建基因表达载体：为使目的基因与载体正确连接，在扩增目的基因时，应在其一对引物的____端分别引入____两种不同限制酶的识别序列。在目的基因和载体连接时，可选用____（填“E.coli DNA连接酶”或“T₄ DNA连接酶”）。
(3)转化：先用____溶液处理大肠杆菌细胞，以提高转化效率。
(4)筛选与鉴定：将转化后的大肠杆菌接种在含____的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分离，结果如图3，____号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。

注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0.2kb的DNA分子条带未出现在图中

(5)发酵工程生产凝乳酶：发酵工程需要对选育的工程菌菌种进行扩大培养，从物理性质上，一般选____培养基进行培养。发酵过程的中心环节是____，必须严格控制好发酵条件，以便获得更多的发酵产品。

【推荐1】植物一生经常遭受各种逆境胁迫，如低温、干旱等。但在长期进化过程中，某些植物已经形成抵抗干旱、低温和高盐等逆境的调控机制，感受并响应各种外界刺激。转录因子OrERF是一类蛋白质，在植物抵抗逆境时发挥重要作用。科研人员从水稻中获得OrERF基因并进行测序，OrERF基因中有义链（非模板链）部分结果如下图。请回答下列问题：

(1)OrERF基因转录时所需启动子的基本单位是______________，转录出的mRNA中起始密码子是______________。
(2)图中三个元件分别在高盐、干旱、低温不同信号诱导下，导致该基因表达出不同OrERF蛋白，以适应高盐、干旱、低温环境，从基因与性状关系分析，此现象能说明______________。
(3)干旱胁迫下植物体内脱落酸含量增加，促进保卫细胞膜上K⁺通道开放，导致保卫细胞______________（填“收缩”或“膨胀”）以适应环境。此时水稻生命活动可能会发生______________。
①部分细胞出现质壁分离②无机盐运输效率升高③氧气释放量减少④细胞无法调节代谢活动
(4)过量Na⁺对植物有毒，通过调控Na⁺、K⁺运输，维持细胞质较低Na⁺/K⁺比值，可提高耐盐性。科研人员尝试利用小麦液泡膜Na⁺/K⁺逆向转运蛋白基因（AINHX基因）培育转基因耐盐烟草。下表是研究中的一些步骤，请据题意完成表格。

实验目的	方法步骤要点
获得目的基因	从小麦①______________中获取AINHX基因
构建载体质粒	将目的基因克隆进Ti载体质粒
大量培养烟草细胞	经②______________获得大量细胞
转化细胞	用③______________法转化烟草细胞
转基因细胞筛选	用含抗生素选择培养基筛选
转基因植株培育	植物组织培养获得转基因植株
转基因植株分析	转基因幼苗转入④______________中培养

【推荐2】多不饱和脂肪酸（PUFAs）是人体必需脂肪酸，为解决猪肉中PUFAs含量不足的问题，研究者从线虫中获得控制PUFAs合成的必需酶基因fat1，培育转fat1基因猪，操作过程如图所示。图中GFP基因表达出绿色荧光蛋白。看图回答下列问题：
   
(1)用PCR技术在体外扩增目的基因时，PCR扩增仪中要加入缓冲液、目的基因、______（至少答两点）等。
(2)从图中可知，在构建基因表达载体时，为克服目的基因自身环化，即线性DNA的末端相互连接，变圆环，以及便于目的基因与载体的连接，切割含目的基因的DNA和载体的限制酶应选用______和______。
(3)构建的基因表达载体中，GFP基因的作用是______。除GFP基因外，未标注出的必需元件还有______。
(4)猪成纤维细胞在培养瓶中培养时，除必须保证环境是无菌、无毒外，还必须定期______，以防止细胞代谢物积累对细胞自身造成的伤害。培养到一定程度后，需要分瓶再继续培养，分瓶后的培养过程称为______，操作时首先用______处理成细胞悬液。
(5)经检测，fat1基因成功整合在猪基因组DNA后，______（填“能”或“不能”）说明成功培育转基因猪，理由是______。

【推荐3】人血清蛋白具有较高的医用价值，科学家利用转基因和胚胎工程等技术，获得可产人血清蛋白的奶牛，过程如图甲所示。图乙表示目的基因，其中箭头处为限制酶的切割位点，且3种限制酶的识别序列各不相同。回答下列问题：

(1)将人血清蛋白基因导入奶牛体细胞中最常用、最有效的方法是__________________。若要检测目的基因是否成功导入受体细胞，则一般采用______技术。
(2)通常用幼龄动物组织或早期胚胎进行动物细胞培养，原因是______。动物细胞体外培养一般分为______和______两个阶段。为使核移植的胚胎或动物的遗传物质几乎全部来自有重要价值的动物体，在体细胞的细胞核植入受体卵母细胞前，必须先进行的操作是__________________。
(3)由图乙可知，切割目的基因时，最适合加入的限制酶是______，但该过程的不足之处在于______（答出1点），从而使部分基因表达载体的构建不成功。

【推荐1】一种天然蛋白t-PA能高效降解因血浆纤维蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和脑血栓的急救药，但是心梗患者注射大剂量的t-PA会诱发颅内出血。研究证实，将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低其诱发出血的副作用。据此，先对天然t-PA基因的碱基序列进行改造，然后再采取传统的基因工程方法表达该改造后的基因，可制造出性能优异的改良t-PA蛋白。下图表示相关的目的基因、载体及限制酶识别序列和切割位点，pCLY11为质粒，请回答下列问题：

(1)可以先提取细胞的_____来合成总cDNA，再从cDNA文库中获取t-PA基因。通过改造t-PA基因制造出性能优异的改良t-PA蛋白的过程被称为_____工程。
(2)若改造后的t-PA基因的黏性末端如上图所示，则需要选用限制酶_____切割质粒pCLY11，保证质粒与t-PA改良基因高效连接。再用DNA连接酶催化形成_____键，构建重组质粒。
(3)以大肠杆菌作为受体细胞，在含新霉素的培养基中形成菌落的受体细胞并非都是目的菌株，原因是_____。成功获取能生产改良t-PA蛋白的工程菌株后，利用_____（填“固体”或“液体”）培养基在发酵罐中进行大量生产。
(4)除了用工程菌株，还可以用下列方法从转基因牛乳汁中获得改良t-PA蛋白：

过程②常用的方法是_____；在过程④前需要取囊胚的_____细胞做DNA分析进行性别鉴定；为了保证t-PA改良基因能在乳腺细胞中表达，构建基因表达载体需要将其与_____等调控元件重组在一起。

【推荐2】回答下列有关问题：
（1）饲料加工过程温度较高，要求植酸酶具有较好的高温稳定性．利用_____工程技术对其进行改造时，通过设计_____，推测_____，进而确定_____，据此获得基因，从而得到新的植酸酶，之后还要对该酶的功能进行鉴定．
（2）培育转植酸梅基因的大豆，可提高其作为饲料原料磷的利用率．将植酸酶基因导入大豆细胞常用的方法是_____．获得转基因植株的完整过程包括：获得外源植酸酶基因→构建基因表达载体→导入大豆细胞→转植酸梅基因的大豆植株再生→_____．
（3）为了提高猪对饲料中磷的利用率，科学家将带有植酸酶基因的重组质粒通过_____转入猪的受精卵中．该受精卵培养至一定时期可通过_____方法，从而一次得到多个转基因猪个体．

【推荐3】科学家利用蛋白质工程技术，研制出了赖脯胰岛素，与天然胰岛素相比，其皮下注射后易吸收、起效快。回答下列问题：
(1)蛋白质工程流程如图所示，物质a是__________，物质b是__________ 。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质氨基酸序列和空间构象却相同，原因是__________。

(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中可利用PCR技术扩增目的基因，在PCR反应缓冲液中需要加入的酶是__________，反应缓冲液中引物的作用是__________。
(3)获取目的基因（S基因）后，为了成功构建重组表达载体，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用__________切割S基因的cDNA和载体。

(4)科研工作者利用微生物发酵生产胰岛素，选择酵母菌做受体细胞比大肠杆菌效果更好，请你从细胞结构方面说明理由：_____________________________________。