【推荐1】基因定点整合可替换特定基因，该技术可用于单基因遗传病的治疗。苯丙酮尿症 是由 PKU 基因突变引起的，将正常 PKU 基因定点整合到 PKU 基因突变的小鼠胚胎干细胞的 染色体 DNA 上，替换突变基因，可用来研究该病的治疗过程。定点整合的过程是：从染色体 DNA 的突变 PKU 基因两侧各选择一段 DNA 序列 HB1 和 HB2，根据其碱基序列分别合成 HB1 和 HB2，再将两者分别与基因 K1、K2 连接，中间插入正常 PKU 基因和标记基因 neor，构建 出如图所示的重组载体。重组载体和染色体 DNA 中的 HB1 和 HB2 序列发生交换，导致两者之 间区域发生互换，如图所示。回答下列问题：

(1)构建重组载体，常用的工具酶有__________。构建重组载体时，需要大量 PKU 基因，常 用__________技术合成 PKU 基因。
(2)题干中所用胚胎干细胞可以来自____________。培养过程中大部分细胞会贴附在培养瓶 壁生长，当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂，这种现象称为 ____________。
(3)实验过程中，为了提高胚胎的利用率，可采用胚胎分割技术，若选用囊胚期的胚胎，操 作过程中要特别注意将内细胞团均等分割，原因是____________。
(4)用图中重组载体转化胚胎干细胞时，会出现 PKU 基因错误整合。错误整合时，载体的两 个 K 基因中至少会有一个与 neor 一起整合到染色体 DNA 上。已知含有 neor 的细胞具有 G418 的抗性。Kl、K2 的产物都能把 DHPG 转化成有毒物质而使细胞死亡。转化后的胚胎干细胞依 次在含有 G418 及同时含有 G418 和 DHPG 的培养液中进行培养，在双重选择下存活下来的是 ________（填“正确整合”或“错误整合”）的胚胎干细胞，理由是_________。

【推荐2】三氯生是一种抑苗物质，可以替代抗生素用于基因工程中筛选含目的基因的受体细胞。2021年某科研团队通过先筛选出一种对三氯生抵抗性较强的重组质粒，再将可以受温度调控的基因插入该质粒上，构建了温度调控表达质粒。

(1)图1中，步骤I需要的工具酶是____________；步骤II常用的方法是用____________处理使细菌成为感受态细胞；为达到步骤III预期的筛选目的，所用物质最可能为____________。
(2)已知fabV基因（-A和-B代表从不同苗中获得）可以使大肠杆菌抵抗三氯生。在图中，fabV-A基因和fabV-B基因是____________（目的/标记）基因。
(3)利用从细菌中提取的DNA通过PCR技术获取fabV-A基因时，需要的特定酶是____________，该酶只能从____________延伸DNA链，而不能从头开始合成DNA，因此需要先根据____________设计两种特异性引物序列。
(4)为获得一种增强大肠杆菌对三氯生的抵抗作用效果较好的重组质粒，将含有不同质粒的大肠杆菌分别接种到相应培养基中。培养一段时间后，结果如图2，则适宜选作构建温度调控表达质粒的是____________。

(5)科学家对上述选出质粒进行改造，获得了图3所示质粒。其中和是启动子，可以启动转录；基因在低温下会抑制基因在高温下会抑制和是终止子，可以终止转录。如果将lacZ基因和GFP基因插入图质粒中，使得最后表现为高温下只表达GFP蛋白，而低温下只表达lacZ蛋白。则以下说法正确的有____________

A．GFP基因插在R基因和终止子T1之间

B．基因插在R基因和终止子T1之间

C．GFP基因插在启动子P2和终止子T2间

D．lacZ基因插在启动子P2和终止子T2之间

【推荐3】H1N1为单链RNA病毒，感染人类会引发甲型流感。对H1N1进行基因组测序，发现HA基因是该病毒的一种特征基因。可通过检测HA基因来检测待测标本中H1N1的含量，过程如下图所示。回答下列问题。

(1)对H1N1进行基因组测序是测定RNA的_______________序列。
(2)在过程①和②中，需分别向反应体系加__________酶和__________酶。
(3)过程②中对HA基因对应的cDNA序列进行扩增，需设计_____种引物。反应体 系中加入dATP、dTTP、dCTP和dGTP的作用是___________________。
(4)反应体系中含有荧光物质，每扩增形成一条DNA链，就会出现一定强度的荧光信号。 现欲检测两个标本中H1N1的含量，可在荧光强度达到某一设定值时，观察比较两个反应体系扩增循环的次数，若某个标本的循环次数较少，则其H1N1含量较 ___________。

【推荐2】质粒A和质粒B各自有一个限制酶EcoRⅠ和限制酶BamHⅠ的识别位点，两种酶切割DNA产生的黏性末端不同。限制酶EcoRⅠ剪切位置旁边的数字表示其与限制酶BamHⅠ剪切部位之间的碱基对数（bp）。在含有质粒A和B的混合溶液中加入限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ，令其反应充分；然后，向剪切产物中加入DNA连接酶进行反应，再将其产物导入大肠杆菌中。（实验中不考虑无ori的质粒、拥有两个或两个以上ori的质粒、两个或两个以上质粒同时进入大肠杆菌、三个或三个以上DNA片段发生连接）请回答下列问题：

ori：质粒复制原点；tet：四环素抗性基因；amp：氨苄青霉素抗性基因；gfp：基因产物在紫外线照射下可发出绿色荧光；lac：基因控制合成的半乳糖苷酶可以水解乳糖
（1）只拥有质粒A的大肠杆菌_______（填“可以”或“不可以”）在含有氨苄青霉素及乳糖作为唯一碳元素来源的培养基中生存。说明理由：_________________________________________________。
（2）DNA连接酶进行反应后，存在______种大小不同的质粒，有________种质粒使大肠杆菌能够在含有氨苄青霉素及乳糖作为唯一碳源的培养基中生存。
（3）绿色荧光蛋白基因是标记基因的一种，标记基因的功能是________。

【推荐3】某研究小组利用转基因技术，将红色荧光蛋白基因（RFP）插入含Gata3基因的载体中，载体和目的基因所在DNA上的限制酶识别位点及PCR扩增使用的相关引物如图甲所示。实验获得能正常表达两种蛋白质的杂合子雌、雄小鼠各一只，利用荧光蛋白活体成像系统进行检测，发现两者均为阳性RFP转基因小鼠。回答下列问题：

(1)为了使RFP基因能正确插入载体中，在PCR扩增RFP编码区序列的过程中，需要设计引物F和R，在两个引物的（填“3”或“5”）______端需分别插入______、______的限制酶识别序列。
(2)引物的另一端将会进行的过程是在__________酶的催化下，以__________为模板将__________。
(3)在RFP基因的扩增及重组载体的构建过程中，共需要__________种酶的参与。
(4)将实验获得的两只雌、雄杂合子小鼠（P）进行杂交获得若干F₁，利用荧光蛋白活体成像系统检测后，随机取阳性小鼠并随机进行交配获得8只F₂小鼠，其表型及比例为阳性:阴性=5:3，为从F₂阳性小鼠中获得Gata3-RFP基因纯合子小鼠，研究人员从这些阳性小鼠中提取Gata3基因相关DNA片段，设计了引物A和C用于PCR扩增，扩增产物如图乙所示，则__________号小鼠是Gata3-RFP基因纯合子小鼠。若用引物A和引物B进行PCR，__________（填‘能”或“不能”）更好地区分杂合子和纯合子。

【推荐1】下图为转基因抗虫烟草的培育流程，①②③④表示过程，其中②表示利用农杆菌转入受体细胞。回答下列相关问题：

（1）在①过程构建重组质粒时，若用同一种限制性核酸内切酶处理Ti质粒和含目的基因的DNA片段，使两者形成黏性末端用于拼接，这种方法的明显缺点是目的基因和质粒____________________________(答出2点即可)。另外，影响拼接效率的主要因素，除以上缺点和盐离子浓度、渗透压、温度等环境因素外，还有____________________________(答出2点即可)。
（2）在②过程中，将图示重组Ti质粒导入农杆菌时，可用_______________处理农杆菌，以提高转化效率。操作之后，需要特定的培养基对农杆菌进行筛选，其原因是_______________，最终筛选到的对象在相应选择培养基上的存活情况是______________________。
（3）在③过程常通过调节植物激素的适当配比，从愈伤组织诱导出胚状体或根芽，并由此再生出新植株。愈伤组织特点_________________________________（写出两点）
（4）为诱导愈伤组织产生不定芽，通常应在培养基中加入两类植物激素，其中起主要作用的是__________________________。

【推荐2】胰岛素属于蛋白类药物，对于Ⅰ型糖尿病患者而言，注射胰岛素是目前有效的治疗方法之一，利用基因工程生产胰岛素使这一治疗方法能够走入寻常百姓家。下列为分子实验室中可以进行的部分实验操作：
①筛选含有胰岛素基因的受体细胞
②胰岛素基因与运载体重组
③重组DNA导入受体细胞
④获取胰岛素基因
1．构建产生胰岛素的基因工程菌的正确流程是____（用题中编号排序）。
2．构建产生胰岛素的基因工程菌的关键步骤中，必需的主要工具酶是_______、_______（填编号）。
①纤维素酶       ②蛋白酶       ③限制酶       ④连接酶       ⑤溶菌酶
3．若选用大肠杆菌作为受体细胞，常采用的运载体是____。
随着基因工程的发展，人类生活中出现了越来越多的基因工程产品，尽管目前尚未发现这些产品的不安全性，但其安全性一直备受关注。
4．你作为一名消费者，对于所消费的商品是否为转基因产品应该具有____。

A．管理权

B．执法权

C．知情权

D．立法权

【推荐3】下图为“乙肝基因工程疫苗”生产过程图解，质粒上箭头所指部位为相应的限制酶的切割位点。质粒中lacZ基因编码产生的酶可以分解培养基中的X-gal，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。请回答下列问题：

   

(1)过程①为了防止目的基因和质粒的自身环化，选用限制酶的最佳方案是___。

A．只有BamHI	B．BamHI和EcoRI
C．EcoRV和BamHI	D．EcoRV和EcoRI

(2)限制酶切割后，需要用DNA连接酶连接形成重组DNA分子，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是___。
(3)构建基因表达载体时，一般将目的基因插在启动子和终止子之间。启动子的作用是___。
(4)基因工程的四步程序是目的基因的获取、构建基因表达载体、___和目的基因的检测与鉴定。其中构建基因表达载体时，所用载体除了质粒以外，还有___（答出2点）。
(5)过程②处理大肠杆菌后，大肠杆菌处于___的生理状态。
(6)为了筛选含目的基因表达载体的大肠杆菌，可在培养大肠杆菌的通用培养基中额外加入___，培养一段时间后挑选出___（填“蓝色”或“白色”）的菌落进一步培养，从而获得大量目的菌。
(7)目的基因导入受体细胞后，常用___技术检测目的基因是否翻译出乙肝病毒外壳。

【推荐1】A．[生物——选修1：生物技术实践]随着全球环境污染严重，石油资源逐步减少，近年来乙醇等“绿色能源”的开发备受关注。科技工作者研制出利用秸秆生产燃料酒精的技术，大致流程如下图所示。

（1）若要从土壤中分离出能分解植物秸秆的微生物，培养基中的碳源是______，对该培养基可采取_____的方法进行灭菌。
（2）某同学对分离得到的微生物培养液进行数量测定，在稀释倍数为10⁵对应的培养基中测定平板上菌落数的平均值为23．4，则每毫升样品中的细菌数是（涂布平板时稀释液的体积为0．2 mL）__________。
（3）用上述方法测定目的菌的密度，实际活菌数量要比测得的菌落数量多，原因是________________。
（4）上述流程图中，糖液发酵产生酒精需要的菌种是____，酒精是在目的菌的__________（结构）中产生的。
B．[生物——选修3：现代生物科技专题]马铃薯块茎含有大量的淀粉，富含多种维生素和无机盐，我国已将马铃薯作为主粮产品进行产业化开发。下图是转基因抗盐马铃薯的培育过程，请分析回答问题：

（1）为获取抗盐基因，可以从碱蓬细胞研磨液中提取抗盐基因的___来合成cDNA。
（2）上图构建基因表达载体时，最好选用_______________酶切割含目的基因的外源DNA和质粒，不能使用Sma l切割的原因是___________。构建好的重组质粒在抗盐基因前要加上特殊的启动子，启动子是一段有特殊结构的_____________片段。
（3）将基因表达载体导入农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA上的原因是____________。通过农杆菌的转化作用，使抗盐基因插入到马铃薯细胞中的染色体DNA上，从而使抗盐基因的遗传特性得以_______________。
（4）上图转基因抗盐马铃薯培育过程中，属于脱分化阶段的是___（填序号）。从个体水平上检验转基因抗盐马铃薯是否培育成功的方法是_____________。

【推荐2】启动子是位于基因端上游的DNA序列，启动子部分碱基序列发生突变，会导致表达障碍。某遗传病是由突变基因α引起的，为了探究突变基因α不能表达是否与启动子有关，将启动子转移至另一表达载体中（载体来自微生物），并进行荧光检测。表中列出了5种限制酶识别序列及其切割位点，图中表示相关限制酶的酶切位点，请回答：

限制酶	BamHI	SmaI	EcoRI	NheI	MunI
识别序列及切割位点	G↓GATCC	CCC↓GGG	G↓AATTC	G↓CTAGC	C↓AATTG

(1)为将启动子定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，切割启动子用的限制酶是_______，切割表达载体用的限制酶是_______，构建基因表达载体需要用的连接酶是______（填“E·coli”或“T₄”）DNA连接酶。
(2)为了进一步提高启动子与载体的连接效率，酶切获得的含启动子的片段（和酶切后的载体）在扩增时，如下图需要在引物的______端添加某特定限制酶识别序列，引物的作用是______，最快扩增______次后可出现已添加特定限制酶识别序列的启动子。
   
(3)将含有上述重组片段的载体正确导入工程菌中后，未表达出荧光，根据_______等技术检测目的基因已成功转录，则突变基因α不能正常表达与启动子无关。

【推荐3】某实验小组利用转基因技术培育耐盐水稻，图A表示含有耐盐基因的外源DNA分子，图B表示质粒，其上含有BamHI、SmaI和HindⅢ三种限制酶的酶切位点。请回答下列问题：

(1)分析上图可知，欲构建重组DNA分子，应选用________________两种限制酶切割质粒和外源DNA分子，使用两种不同的限制酶切割目的基因的优点是________________________。
(2)题（1）中不使用另外一种限制酶切割的原因是______________________，题（1）中构建成功的重组质粒若用该酶切割能产生____________种不同的DNA片段。
(3)质粒中的抗性基因的作用是____________。成功导入了目的基因的受体细胞（受体细胞本身不含四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因），不能在含____________（填“氨苄青霉素”或“四环素”）的培养基中进行培养。