【推荐3】我国是棉花的生产和消费大国。棉花种植时容易受到棉铃虫侵袭，严重时可使棉田绝收。苏云金杆菌能产生Bt抗虫蛋白来杀死棉铃虫。我国科学家将该细菌的杀虫基因转到棉花细胞中，让棉花产生Bt抗虫蛋白（编码基因长约2000bp）来抵抗虫害。回答下列问题。
(1)对Bt抗虫蛋白基因进行PCR扩增时，为维持酶活性，需要在一定的________（溶液）中进行。随后使用两种限制酶BamHI和HindⅢ同时酶切已扩增的目的基因和质粒，再使用_________进行连接，可防止目的基因、质粒的自身环化或反接，随后用重组表达载体（大小为5000bp）转化大肠杆菌。
(2)为检测目的基因是否已成功导入大肠杆菌，研究人员从大肠杆菌菌落提取质粒后，分别使用BamHI和HindⅢ双酶切、BamHI单酶切，通过电泳检测酶切结果，并采用未转化的大肠杆菌菌落作为对照，依据图a判断，目的基因_________（填“已”或“未”）导入大肠杆菌，若要证明双酶切产物中2000bp为目的基因片段，采用的检测方法有_______（写出1种）。

   

(3)研究人员将重组表达载体导入棉花细胞并成功表达出Bt抗虫蛋白。研究发现，Bt抗虫蛋白被害虫分解为多肽后，与害虫肠道上皮细胞的细胞膜结合，导致细胞膜穿孔，使害虫渗透压失衡而死亡。形成的孔道结构越稳定，Bt抗虫蛋白对害虫的毒性越大。

   

①已知Bt抗虫蛋白部分结构参与了昆虫肠上皮细胞膜中孔道的形成。该部分结构中存在多个螺旋，其中第5号螺旋中部疏水，两端亲水（图b），从细胞膜结构的角度分析，第5号螺旋能够贯穿于细胞膜的原因是_______。
②研究人员通过解析Bt抗虫蛋白晶体的结构发现，第5号螺旋处的第168位氨基酸是孔道结构稳定性的关键，将该位点氨基酸替换为疏水性更强的精氨酸后，就有可能提高孔道结构的稳定性。根据这一研究结果，请写出后续利用蛋白质工程培育出抗虫能力更强的转基因棉花的基本思路：________。