【推荐1】基因工程的第一步是筛选获取目的基因，利用PCR技术获取目的基因是一种常用的手段。图示是某DNA分子经酶切后，DNA片段自身环化并利用PCR技术扩增的部分过程。
   
(1)PCR与生物体内DNA复制过程不同，PCR反应中解旋不需要_________酶催化而是通过_________实现的，因此PCR技术使用的DNA聚合酶必须是_________的。
(2)如果在某基因组中定位了一个目的基因X，其碱基序列未知，但已知X临近区域的一段DNA序列，此时可利用图示方法进行目的基因的筛选和扩增。作用于图示多个限制酶切点的限制酶种类一般应_________（填“相同”或“不同”）。操作时根据图中的_________设计引物，将含有目的基因的DNA片段克隆出来。
(3)实践中也常用RT-PCR技术扩增目的基因，这种技术是以RNA为模板。若利用RT-PCR技术扩增胰岛素基因，应选择_________细胞提取RNA。

【推荐2】虾青素可由β-胡萝卜素在β-胡萝卜素酮化酶（BKT）和β-胡萝卜素羟化酶（CRTR-B）的作用下转化而来，具有抗衰老、增强免疫、保护心血管等功能，杜氏盐藻是单细胞浮游植物，生长快，易培养，能大量合成β-胡萝卜素，科研人员将BKT基因和CRTR-B基因导入杜氏盐藻，构建杜氏盐藻细胞工厂高效生产虾青素。
(1)获取目的基因：雨生红球藻是天然虾青素重要来源，提取雨生红球藻的总DNA为模板，设计特异性引物扩增BKT基因和CRTR-B基因，此过程需要____________酶的催化。

   

(2)构建转化载体：“无缝克隆法”是构建重组质粒的新方法，指利用同源重组酶将末端具有一致同源序列的线性化载体和目的基因连接形成重组质粒，图1表示利用“无缝克隆法”向质粒中插入抗除草剂基因的基本过程。
Ⅰ．PCR获取抗除草剂基因过程中，为确保基因两端具有所需同源序列，需在引物的__________端添加对应的同源序列。若要确保抗除草剂基因能够从重组质粒中切除，还需要在基因两侧加入限制酶识别序列，则所需引物（5'-3'）的序列应为：_______。
A．同源序列+特异性扩增引物序列+限制酶识别序列
B．同源序列+限制酶识别序列+特异性扩增引物序列
C．特异性扩增引物序列+限制酶识别序列+同源序列
Ⅱ．科研人员利用“无缝克隆法”同时将BKT基因和CRTR-B基因插入质粒，形成的重组质粒对应部位如图2所示，推测此过程扩增BKT基因所用的引物为__________；扩增CRTR-B基因所用的引物为___________；
Ⅲ．最终形成的重组质粒如图3所示，其中atpA启动子和psbA启动子均为杜氏盐藻叶绿体启动子，选用内源性启动子的目的是_____________；
IV．与传统的酶切法构建重组质粒相比，“无缝克隆法”具备的优势有________（2分）
(3)目的基因导入及相关检测：采用基因枪法将重组质粒导入杜氏盐藻叶绿体，一段时间后，用含__________的培养基筛选已转化的杜氏盐藻，通过相关技术检测目的基因是否成功表达。
(4)叶绿体转化是植物基因工程的新热点，叶绿体的诸多特点为叶绿体转化提供优势，如叶绿体基因组小，功能清晰，使基因操作方便；叶绿体细胞具有自我复制功能，一个植物细胞可含有多个叶绿体，每个叶绿体中含有多个基因组，可大大提高_____________；另外，叶绿体基因位于细胞质中，可有效避免__________。

【推荐3】临床上人血清白蛋白主要作为血浆容量扩充剂广泛应用于出血性休克、烧伤等的治疗。研究人员利用农杆菌转化法将人血清白蛋白基因导入水稻胚乳细胞中，成功培育出能产生人血清白蛋白的转基因水稻。回答下列问题：
(1)利用血清白蛋白mRNA，在___________的催化下获得双链DNA片段（血清白蛋白基因），再利用PCR技术扩增得到血清白蛋白基因。PCR扩增时，要设计一对引物（引物1和引物2），PCR过程完成三次循环所需引物的总数为 _____________
(2)在构建基因表达载体时，常用同种限制酶对含人血清白蛋白基因的DNA片段和Ti 质粒进行酶切，目的是__________________。在基因工程中，农杆菌Ti质粒上的T-DNA片段的功能是__________________________。
(3)血清白蛋白基因应插入Ti质粒中启动子的下游，其原因是 __ ；除此之外，构建的表达载体还需要具有的结构有________（答出两点即可）。
(4)与利用乳腺生物反应器生产人血清白蛋白相比，利用转基因植物生产药用蛋白的优势在于______（答出三点即可）。

【推荐2】1992年，我国科学家成功研制了具有自主知识产权的Bt转基因抗虫棉。Bt基因的两端存在EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，如图甲所示；质粒表达载体如图乙所示，amp^R为青霉素抗性基因，tet^R为四环素抗性基因，P为启动子，箭头表示酶切位点。

（1）EcoRⅠ、BamHI等这类酶主要从_____ 生物中分离纯化出来，这些酶并不切割自身的DNA分子的原因可能是_________。
（2）培育转基因抗虫棉的核心工作是________。进行这一工作的目的是________。
（3）构建重组质粒时，只选用EcoRⅠ效率偏低，若选用________限制酶，效率更高的，原因是________。
（4）我国新疆棉区大规模种植抗虫棉的农场都种植了非抗虫棉作为棉铃虫庇护所，从生物进化角度分析这样做有何作用？________________。

【推荐3】微藻细胞质基质中含有大量蛋白质水解酶，叶绿体中不含蛋白质水解酶，科研人员将绿色荧光蛋白基因（gfp基因）导入微藻的叶绿体基因组中，培育出了发绿色荧光的微藻。请回答下列问题：
(1)构建基因表达载体要用___________________处理基因和质粒特定核苷酸之间的_______________，使两者露出相同的黏性末端，目的基因的首尾两端要插入到___________之间。
(2)构建基因表达载体的目的是___________________________。
(3)将gfp基因导入叶绿体基因组中，而不导入细胞核的原因是______________。
(4)检测gfp基因是否成功导入受体细胞以及目的基因是否成功转录，均要用到DNA探针，DNA探针是指_________________________________________。

【推荐1】为增加油菜种子的含油量，研究人员尝试将酶D基因与位于叶绿体膜上转运肽的基因相连，导入油菜叶片细胞并获得了转基因油菜品种。

（1）如图，选用图中的限制酶__________处理两个基因后再用___________酶处理，得到________（填图中字母）端相连的融合基因。
（2）将上述融合基因插入上图所示Ti质粒的_________中，构建_____________并导入农杆菌中。
（3）将获得的农杆菌接种在含__________的固体平板上培养得到单菌落，利用液体培养基振荡培养，得到用于转化的浸染液。
（4）利用________法将目的基因导入油菜叶片中，并通过筛选获得转基因油菜细胞，通过_________技术可培育成转基因油菜植株。

【推荐2】赖氨酸是人体细胞不能合成的必需氨基酸。科学家把某种必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因（R）导入玉米中，使玉米中赖氨酸的含量提高30%。据下图回答下列问题。

(1)利用PCR技术扩增R基因时，需要在一定的缓冲液中才能进行，其中需要加入酶和激活该酶所需的__________。为了特异性扩增R基因序列，需根据__________设计特异性引物。
(2)在构建基因表达载体时，若为了避免R基因和质粒的自连或反向连接，提高重组效率，应该选择的限制酶是__________。
(3)随着转化方法的突破，农杆菌侵染玉米这种单子叶植物也取得了成功。科研人员从新鲜的玉米叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，当农杆菌侵染玉米细胞后，能将__________上的T-DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到__________。
(4)检测R基因是否表达的方法是__________。
(5)在基因工程中若要培养转基因小鼠，将基因表达载体导入受体细胞常用的方法是__________，常用的受体细胞是__________。

【推荐3】基因工程：制备新型酵母菌
(1)已知酵母菌不能吸收淀粉，若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉发酵，则应导入多步分解淀粉所需的多种酶，推测这些酶生效的场所应该是________(填“细胞内”或“细胞外”)。

(2)同源切割是一种代替限制酶、DNA连接酶将目的基因导入基因表达载体的方法。当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入。研究人员运用同源切割的方式，在目的基因两端加上一组同源序列A、B，已知酵母菌体内DNA有许多A－B序列位点可以同源切割插入。构建完成的目的基因结构如图，则应选择图中的引物________对目的基因进行PCR。
(3)已知酵母菌不能合成尿嘧啶，因此尿嘧啶合成基因(UGA)常用作标记基因，又知尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒的物质。
Ⅰ.导入目的基因的酵母菌应在____________的培养基上筛选培养。由于需要导入多种酶基因，需要多次筛选，因此在导入一种目的基因后，要切除UGA基因，再重新导入。研究人员在UGA基因序列两端加上酵母菌DNA中不存在的同源C、C′序列，以便对UGA基因进行切除。C、C′的序列方向将影响切割时同源序列的配对方式，进而决定DNA片段在切割后是否可以顺利重连，如图，则应选择方式________进行连接。

Ⅱ.切去UGA基因的酵母菌应在________的培养基上筛选培养。
(4)综上，目的基因、标记基因和同源序列在导入酵母菌的基因表达载体上的排列方式应该如图________。

【推荐1】抗体的结构如图所示，它有两条H链和两条L链。同一物种C区氨基酸序列恒定，不同抗体的结合抗原的V区氨基酸序列有差异。

（1）抗体结构中的肽键数目为p，氨基酸数目为a，二者的关系式为_____________。
（2）取免疫后小鼠的B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，经筛选得到杂交瘤细胞。将得到的杂交瘤细胞进行克隆化培养和_____________检测以获得具有_____________特点的杂交瘤细胞。将得到的杂交瘤细胞进行体内培养或放入____________培养箱进行体外培养，从细胞培养液中提取出单克隆抗体。
（3）由于鼠源性抗体会使人产生免疫反应，导致该抗体失效，科学家制备了嵌合性单克隆抗体，初步解决了这一问题。推测嵌合性抗体应由鼠源性抗体的___________区和人抗体的___________区组合而成。
（4）为进一步获得更符合治疗要求的单克隆抗体，科研人员对抗体结构进行精细研究，找到既不影响抗体空间结构又降低免疫反应的__________序列，通过基因工程技术对抗体结构进行人源化改造。这种人源单克隆抗体属于____________工程的产物。

【推荐2】下图表示利用细胞融合技术进行基因定位的过程，在人一鼠杂种细胞中人的染色体会以随机方式丢失，通过分析基因产物进行基因定位。回答下列问题：

(1)人、鼠细胞融合形成杂种细胞应用了细胞膜的结构特点是__________，加入灭活仙台病毒的作用是__________。
(2)对杂种细胞进行培养时，培养基中除必要的营养外通常需要加入__________等一些天然成分；为了保证无菌，除了对培养基和所有培养用具进行无菌处理，还需要__________，以防培养过程中的污染。
(3)现检测细胞I、Ⅱ、Ⅲ中人的4种酶活性，只有Ⅱ具有芳怪羟化酶活性，只有Ⅲ具有胸苷激酶活性，I、Ⅲ都有磷酸甘油酸激酶活性，I、Ⅱ、Ⅲ均有乳酸脱氢酶活性。由此可得出：芳烃羟化酶基因位于__________号染色体上，乳酸脱氢酶基因位于__________号染色体上，磷酸甘油酸激酶基因位于__________染色体上。
(4)在动、植物细胞工程中，细胞融合技术的意义是__________。

【推荐3】在肿瘤患者的治疗中，被动免疫治疗适用于肿瘤晚期患者，主要分为单克隆抗体治疗和过继性细胞治疗两类。利用单克隆抗体和高效细胞毒类药物结合生产的药物ADC可以有效杀伤肿瘤细胞。ADC的作用机制和过继性细胞治疗相关过程如下图所示。回答下列问题：

(1)在单克隆抗体制备过程中，初步筛选出来的杂交瘤细胞进行____________和抗体检测才可以获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。
(2)图1所示ADC（抗体—药物偶联物）模式图中，①表示_____________。
(3)图2所示过继性细胞治疗中，可以用____________（实验器材）将从肿瘤患者体内获取的多种免疫细胞一一分离，对这些分离的细胞进行单克隆培养过程中会出现分裂受阻，其原因主要有细胞密度过大、有害代谢物积累、培养液中营养物质缺乏，还有可能发生___________现象