【推荐3】PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为0．9kb（1kb=1000碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：
(1)为获取phb2基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经__________过程得到cDNA，将其作为PCR反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。
(2)图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2基因（该基因序列不含图1中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入__________和__________两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用__________（填“E．coliDNA连接酶”或“T₄DNA连接酶”）。

相关限制酶的识别序列及切割位点

名称	识别序列及切割位点	名称	识别序列及切割位点
HindⅢ	A↓AGCTT TTCGA↑A	EcoRI	G↓AATTC CTTAA↑G
PvitⅡ	CAG↓CTG GTC↑GAC	PstI	CTGC↓AG GA↑CGTC
KpnI	G↓GTACC CCATG↑G	BamHI	G↓GATCC CCTAG↑G

注：箭头表示切割位点
(3)转化前需用CaCl₂处理大肠杆菌细胞，使其处于__________的生理状态，以提高转化效率。
(4)将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电分离，结果如图2，________号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。

注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0．2kb的DNA分子条带未出现在图中
(5)将纯化得到的PHB2蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中，培养24小时后，检测处于细胞周期（示意图见图3）不同时期的细胞数量，统计结果如图4。分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的原因是将细胞阻滞在细胞周期的__________（填“G₁”或“S”或“G₂/M”）期。

【推荐1】研究显示，结肠癌等多种恶性肿瘤细胞会表达hCGβ蛋白，这与肿瘤的发生及转移可能有一定关系。通过各种生物反应器研发抗hCGβ蛋白已成为近年来肿瘤治疗领域热点问题，下图1、2、3为各团队制备过程的部分流程图和实验结果图，其中启动子有物种特异性，请根据实验过程和实验结果回答以下问题：

注1：序列甲（320bp）指导合成的信号肽，能指引翻译后的多肽进入内质网腔注2：AXO1为甲醇诱导型的真核启动子，有甲醇存在的环境下才会启动表达
(1)构建重组载体。图中获取抗β基因的方法属于__________，将抗β基因与甲序列一起构建形成融合基因，并与线性质粒连接。
(2)大肠杆菌转化。阶段 II 将环化质粒导入受体细胞，然后涂布于含氨苄青霉素的平板，在恒温培养箱中__________培养，以利于获得单菌落，筛选分离出含抗β基因的大肠杆菌。
(3)鉴定融合基因。为鉴定抗β基因与甲序列是否融合成功；提取大肠杆菌的__________作为模板，设计相应引物对融合基因进行PCR并电泳。在PCR过程中，每一个循环均包括__________（填序号）3个阶段。为使扩增产物能被限制酶用于后续实验，应在引物5’端添加__________，电泳时将伴样品与__________混合后加入加样孔。凝胶中加样孔的一侧放于电泳槽的__________（填“正极”或“负极”）。电泳后得到图2所示结果，据图可判断__________号泳道的样品符合要求。
(4)导入酵母菌。阶段 IV-V过程，将处理后的酵母菌接种__________（填“固体”或“液体”）培养基，培养基不需要添加以下哪一种成分__________（A组氨酸   B甲醇   C无机盐   D琼脂），此培养基上形成的母菌菌落即为目的菌株，此步骤不能通过培养基中添加氨苄青霉素作为筛选条件获得目标菌株的原因是______________。
(5)基因表达检测，将酵母菌接种后于__________上振荡培养，将培养物离心后分成细胞和培养液两部分，将细胞用缓冲液重新悬浮，并______________处理后，再次离心取上清。用hCGβ蛋白对上清液和之前获得的培养液分别进行__________检测，若两组均呈阳性，则说明基因在酵母菌中成功表达并分泌。
(6)发酵罐生产：为了解发酵罐中酵母菌数量，取5g皮渣加入45mL无菌水，按照此法，梯度稀释至10⁴倍。取0.1mL稀释液涂布计数，三个平板中苗落数分别为56、62和56，则此时每克皮渣酵母菌数量是__________个。
(7)为便于纯化抗β蛋白，现改进生产线路，另将小段His基因序列（标签）与抗β基因相连，构建出能表达抗β-His融合蛋白的重组DNA（图3）。为确定融合基因插入并且方向正确，进行PCR检测，可选择图3中的引物组合为__________（写出所有组合方式）。除利用His蛋白的特异性吸附能力进行蛋白分离，还可利用蛋白电泳，其原理是根据蛋白质分子的电荷、_________及形状不同，在电场中的移动速度不同而实现分离。

(8)研究者发现，用植物生产可能更加经济，拟用紫藤花生产。用农杆菌转化法时，携带目的基因的____________________会转移到植物细胞中。
(9)植物源蛋白活性检测、已知DNS在90℃以上可与还原糖发生显色反应，将β蛋白与淀粉酶制成β-酶复合体，抗β-酶复合体蛋白与β蛋白结合后会盖复合体空间构象，使酶无法正常执行功能。向离心管加抗β蛋白、β-酶复合体反应10min，再加入淀粉反应10min，立刻沸水浴处理2min，此时沸水浴的目的是__________。随后加入DNS并沸水浴处理10min，通过测定反应液的颜色变化，推测抗β蛋白的活性。颜色反应越深，可以反映抗β蛋白的活性越_________。