【推荐1】PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为0．9kb（1kb=1000碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：
(1)图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使PHB2基因（该基因序列不含图1中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的PHB2基因两端分别引入__________和__________两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的PHB2基因和载体进行连接时，可选用__________（填“E·coli DNA连接酶”或“T₄DNA连接酶”）。

相关限制酶的识别序列及切割位点

名称	识别序列及切割位点	名称	识别序列及切割位点
HindⅢ	A↓AGCTT TTCGA↑A	EcoRI	G↓AATTC CTTAA↑G
PvitⅡ	CAG↓CTG GTC↑GAC	PstI	CTGC↓AG GA↑CGTC
KpnI	G↓GTACC CCATG↑G	BamHI	G↓GATCC CCTAG↑G

注：箭头表示切割位点
(2)转化前需用CaCl₂处理大肠杆菌细胞，使其处于__________的生理状态，以提高转化效率。
(3)将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用（1）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电分离，结果如图2，________号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。

注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0．2kb的DNA分子条带未出现在图中
(4)将纯化得到的PHB2蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中，培养24小时后，检测处于细胞周期（示意图见图3）不同时期的细胞数量，统计结果如图4。分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的原因是将细胞阻滞在细胞周期的__________（填“G₁”或“S”或“G₂/M”）期。

【推荐2】糖化酶是将淀粉转化为葡萄糖的酶，大部分野生酵母菌因缺乏糖化酶基因而不能直接利用淀粉。研究人员将经诱变处理后获取的黑曲霉菌高产糖化酶基因导入毕赤酵母GS115（对氨苄青霉素不敏感）中，构建能直接利用淀粉的工程菌，该过程所用质粒（仅示部分结构）如图1所示。三种限制酶的识别序列及切割位点见表，请回答下列问题。

限制酶	BamHI	PstI	XbaI
识别序列和切割位点（5’→3’）	G↓GATCC	C↓TGCAG	T↓CTAGA

(1)为获得糖化酶高产菌株，研究人员将经诱变处理后的黑曲霉菌接种到_______含量高的培养基上，恒温培养适宜时间后滴加碘液，挑选出透明圈（不产生蓝色）直径________（填“较大”或“较小”）的菌株。再进行复筛以及稳定性遗传实验。
(2)构建高产糖化酶基因表达载体时，用限制酶切割质粒pPIC9K，图2是高产糖化酶基因示意图（仅示部分碱基），为使其能定向插入表达载体并成功表达，应在引物的__________（5'或3'）端添加__________酶识别序列，则PCR扩增时引物的碱基序列应为下列①-⑥中的_________。若扩增4次，不同时含两种引物的DNA分子有_______个。

(3)将筛选出的菌株接种至发酵罐内进行扩增，在接种环节要对培养基和发酵设备进行严格灭菌以防止杂菌污染的原因是_________（答出一点即可）。培养过程中可定期取样并常用_______（仪器名称）对菌体进行直接计数，以评估增殖情况。如发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束后采用_______（答出1项即可）等方法获得所需的发酵产品。

【推荐3】北极比目鱼中有抗冻基因，下图是获取转基因抗冻番茄植株的过程示意图，过程①的mRNA序列为5'-AUCUAUGCGCUCAUCAG…（中间省略3n个核苷酸序列）…CGCAGCAAUGAGUAGCG-3'。请回答：
   
(1)过程②中既能连接黏性末端又能连接平末端的DNA连接酶是_____。
(2)为使过程①获取的目的基因能整合到番茄细胞的染色体的DNA上，在构建表达载体时，需要将目的基因插入______中，并且需在目的基因的首端和尾端分别加入_____。
(3)在分子水平上要检测番茄的DNA上是否插入了抗冻基因或抗冻基因是否转录出了mRNA，可以通过______等技术检测；要确认抗冻基因是否在转基因番茄植株中完全表达，应通过_____法检测转基因番茄植株中该基因的表达产物是否呈阳性。
(4)如果目的基因进行PCR扩增，循环5次，理论上至少需要加入______个引物，扩增的产物中同时含有两种引物的DNA分子有_____个，可选用的引物是_____。
①5′-ATCTATGCGCTCATCAG-3′       ②5′-GACTACTCGCGTATCTA-3′③5′-CGCAGCAATGAGTAGCG-3′       ④5′-GCGATGAGTAACGACGC-3′⑤5′-TAGATACGCGAGTAGTC-3′⑥5′-CGCTACTCATTGCTGCG-3′

【推荐1】果荚开裂并释放种子，是植物繁衍后代的重要途径。模式植物拟南芥果荚的开裂与传统油料作物具有相似的调控机制。研究者对拟南芥果荚开裂机理进行了系列研究。
（1）植物果荚开裂区域细胞的细胞壁在_________等酶的作用下被降解，导致果荚开裂。野生型拟南芥果荚成熟后会完全开裂，以便种子传播。
（2）研究者通过筛选拟南芥T-DNA插入突变体库，获得两个果荚不开裂的突变体甲和乙。检测发现突变体甲的M酶活性丧失，推测编码M酶的M基因由于插入T-DNA，突变为m基因。研究者利用不同的引物对，分别进行PCR，检测野生型拟南芥及突变体甲的基因型，结果如图1 所示，验证了上述推测。在图2中标出引物1、2的位置及方向。_________

（3）进一步研究发现突变体乙的E酶活性丧失。另有一突变体丙的果荚开裂程度介于不开裂与完全开裂之间（中等开裂）。突变体乙、丙的果荚开裂程度分别由E/e、A/a基因控制。将上述突变体进行杂交，后代表型及比例如下表所示。

杂交组合	F1表现型	F2表现型及比例
乙×丙	完全开裂	完全开裂：中等开裂：不开裂＝9：3：4
甲×丙	完全开裂	完全开裂：中等开裂：不开裂＝2：1：1

图3为甲与丙杂交所得F₁的部分染色体示意图，基因M、m的位置已标出，在图3中标出基因E/e、A/a可能的位置_________。据上述信息，预测甲与乙杂交所得F₁的表现型及比例为_________，F₁自交所得F₂的表现型及比例为_________。

（4）一些油料作物如油菜，若果荚过早开裂，会降低种子收获产量，从而影响经济收入。预测本研究成果在农业生产上的应用_________。

【推荐2】已知组成型启动子可以高效地启动目的基因在植物各种组织中的表达，但常会阻碍植物的生长发育。诱导型启动子可在特定环境条件下诱导目的基因的表达。沙冬青脱水素基因（AmDHN基因）能使植株具有较强的抗旱作用。科研人员通过构建AmDHN基因表达载体，以培育耐旱苜蓿新品种，所用载体如下图所示，请回答下列问题：
   
(1)用载体1构建含AmDHN目的基因的表达载体，可以成功转化苜蓿，但会出现抑制抗性芽生长和抗性植株生根的现象，推测³⁵S启动子属于_________启动子。
(2)下图是科研人员扩增Rd29A启动子所设计的引物，根据引物的碱基序列及限制酶的识别序列分析，构建载体2时选用的限制酶是________________。为了改造载体1中的启动子，需要用________________酶切割载体1、2为最佳。
上游引物P1：5＇-GACCCGGGTTTCCAAAGATTTTTTTC-3＇
下游引物P2：5＇-GAGAGCTCTGGGGTTTTGCTTTTGAATGT-3＇
(3)构建Rd29A启动子驱动AmDHN基因的表达载体后，先将其导入________，再转化苜蓿。转化后应在培养基中添加________进行筛选。
(4)为检测转基因苜蓿中AmDHN基因的表达水平，科研人员做了相关实验。下表呈现了部分操作步骤，请完成表格：

实验步骤的目的	简要操作过程
①_______	在转基因无菌苗根系长至 2～3 cm 时，将培养无菌苗三角瓶的封口膜打开，培养一周，观察其生长状况
提供适宜生长条件	将甲组幼苗根系置于300mL水中
模拟干旱胁迫条件	②____________
无关变量控制	将甲、乙两组置于温度、光照等条件适宜且相同的环境中培养8h，之后剪取两组叶片放在液氮中储存
③________	对叶片研磨、离心后，提取④________，以AmDHN和MtActin基因⑤________为依据设计引物，进行RT-PCR扩增，其中MtActin（一种细胞骨架蛋白）为内参。扩增产物用⑥ _______检测，EB（溴化乙锭）染色照相如图。

【推荐3】下面是将某细菌的基因A导入大肠杆菌内，制备“工程菌”的示意图．

请据图回答：

（1）制备“工程菌”的基本操作程序主要包括四个步骤，其中的核心步骤是_____________。
（2）若A为未知的目的基因，获得A常用的方法是_____________。
（3）A、B形成C的过程中，需要的工具酶有_____________和_____________。为了利于C进入D,常用__________________处理D。
（4）制备所得的“工程菌”用LB____________培养基进行扩大培养，操作过程中要用________和______________来配制该培养基，还要加入一定量的________，以维持一定的渗透压；培养基使用前必须用___________进行灭菌处理。

【推荐1】利用单克隆抗体特异的作用于埃博拉病毒侵染蛋白（VP40蛋白）是一种战胜埃博拉病毒的有效途径。请据图回答：

（1）过程①中选用两种限制酶切割，使目的基因的两端产生不同的黏性末端，这样处理的目的是___________。
（2）图中过程②需要用___________处理大肠杆菌，原因是_____________________。
（3）在基因表达载体中，VP40蛋白基因的首端必须含有___________，其作用是能够被___________识别和结合，从而保证③顺利完成。
（4）为检测VP40基因是否成功表达，可以采用___________技术。VP40蛋白抗体能够战胜埃博拉病毒的原因是______________________。

【推荐3】土壤盐渍化影响水稻生长发育，将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培有耐盐碱水稻新品种，其操作流程及可能用到的限制酶如图，其中bar为抗除草剂基因，Tet^r为四环素抗性基因，Amp³为氨苄青霉素抗性基因，①～⑦表示操作过程，请回答下列问题：
   

限制酶	BamHⅠ	BclⅠ	smaⅠ	Sau3AⅠ
识别位点及切割位点	-G↓GATCC-	-T↓GATCA-	-CCC↓GGG-	-↓GATC-

(1)过程①PCR扩增OsMYB56基因时加需要添加引物，其作用是______；应选用引物组合______。
a．5'-CTTGGATGAT-3'       b．5'-TAAGTTGTCT-3'     c．5'-TAGTAGGTTC-3'
d．5'-TCTGTTGAAT-3'       e．5'ATTCAACAGA-3'       f．5'ATCATCCAAG-3'
(2)根据基因表达载体的结构组成分析，Ti质粒中的CaMV35S是______；OsMYB56基因和bar基因编码链的方向______（填“相同”或“相反”）。
(3)过程③应选用限制酶______切割质粒，利用所选限制酶进行操作的优势是______，切割后需要用______进行连接才能获得重组质粒。
(4)为了筛选出含重组质粒的受体细胞，④过程应在添加______的选择培养基上培养。培养后获得的菌落不能判定是否含有重组质粒，原因是______。
(5)转基因水稻对盐碱环境具有较强适应性，但安全性也需要引起重视。从基因安全的角度考虑，培育和种植过程需要完成下列哪些工作       

A．转化过程残留农杆菌及其废弃的培养基等，需要经灭菌后专门化处理

B．对转基因水稻进行盐碱胁迫实验和除草剂抗性实验，完成个体生物学水平的鉴定

C．转基因水稻移植到大田后，要划定隔离区，防止OsMYB56和bar基因通过花粉传播

D．进行严密的毒理性评价、致敏性评价、营养学评价等食用或饲用安全评估