12. 胰蛋白酶抑制剂能干扰昆虫的代谢,引起昆虫死亡,但对人体无害。科学家将马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因(Pin-Ⅱ)通过农杆菌导入杨树细胞,培育成了抗虫杨树。
注:左图表示含目的基因的DNA分子,下图表示质粒,图中Amp
r表示氨苄青霉素抗性基因,Neo
r表示新霉素抗性基因,复制原点是质粒DNA复制的起点。箭头表示识别序列完全不同的4种限制酶的酶切位点。
回答下列问题:
(1)要获得大量的目的基因,通常采用PCR扩增技术,在PCR扩增仪中已加入了一定的缓冲溶液、含目的基因的DNA分子、Mg
2+,还需要加入的物质有
_________。通过PCR技术扩增Pin-Ⅱ基因片段,反应过程一般由95℃热变性、55~60℃引物和模板配对、72℃延伸三个步骤,经过多次循环完成。延伸阶段选用72℃而非95℃综合考虑了两个因素,这两个因素是
________和
________。
(2)图中的质粒在基因工程操作中通常用作载体,能在受体细胞内稳定存在,除含有Amp
r,Neo
r和多个限制酶切位点外,质粒还具有的主要特点是
________。
(3)依据图中信息,写出高效构建含Pin-Ⅱ基因片段的重组质粒的简要操作方法:
_________。
(4)用转基因杨树叶片喂养某种杨树害虫,发现害虫死亡率显著增加,与非转基因的杨树细胞相比较,此转基因杨树的叶片细胞中,可以检测到的物质有
_____、
____、
____。(写3项)