【推荐1】毕赤酵母（能以甲醇为唯一碳源）可作为生产抗原蛋白的工程菌。研究人员以pPIC9K质粒为载体，构建含乙型肝炎病毒表面抗原蛋白基因HBsAg的重组质粒，酶切后导入毕赤酵母，经同源重组整合到其染色体DNA上并实现复制与表达，部分过程如下图。其中5'AOX1为AOX1基因启动子（一种甲醇诱导型启动子），3'AOX1（TT）为AOX1基因终止子，3'AOX1为AOX1基因的部分序列（同源重组的重要位点之一），Bg1Ⅱ、SacⅠ、SnaBⅠ和AyrⅡ为限制酶酶切位点，HBsAg基因中“→”表示基因转录方向。回答下列问题。

(1)过程①PCR除需要加入Taq酶、dNTP、缓冲液、Mg²⁺外，还需加入___和___。
(2)为了后续将目的基因定向插入质粒，在进行过程①时应在HBsAg基因两侧的A和B端分别添加的碱基序列是___、___。
(3)过程③需用一定浓度的___处理大肠杆菌使其成为感受态细胞，将重组质粒导入大肠杆菌的目的是___。
(4)若用限制酶SnaBⅠ、Bg1Ⅱ联合酶切pPIC9K质粒，获得的DNA片段的长度分别是38kb、27kb、67kb，用限制酶BgⅢ、AvrⅡ联合酶切pPIC9K质粒，得到的DNA片段的长度分别是38kb、40kb、54kb：已知HBsAg基因长度是55kb。则过程⑤应选用的限制酶是___，获得的重组DNA的长度为___。
(5)转化的酵母菌需在培养基中加入甲醇，其目的是___。

【推荐2】产脂肪酶酵母可用于含油废水处理。为筛选产脂肪酶酵母菌株，科研人员开展了相关研究。请回答下列问题：
(1)常规微生物实验中，下列物品及其灭菌方法

编号	①	②	③	④
物品	培养基	接种环	培养皿	涂布器
灭菌方法	高压蒸汽	火焰灼烧	干热	臭氧

正确的是_________（填编号）
(2)称取1. 0g某土壤样品，转入99mL无菌水中，制备成菌悬液，经梯度稀释后，获得细胞密度不同的菌悬液。分别取0. 1ml菌悬液涂布在固体培养基上，其中10倍稀释的菌悬液培养后平均长出了46个酵母菌落，则该样本中每克土壤约含酵母菌_________个。
(3)为了进一步提高酵母菌产酶能力，对分离所得的菌株，采用射线辐照进行诱变育种。将辐照处理后的酵母菌涂布在以_________为唯一碳源的固体培养基上，培养一段时间后，按照菌落直径大小进行初筛，选择直径_________的菌落，纯化后获得A、B两突变菌株。
(4)在处理含油废水的同时，可获得单细胞蛋白，实现污染物资源化。为评价A、B两菌株的相关性能，进行了培养研究，结果如图。据图分析，应选择菌株_________进行后续相关研究，理由是_________.

【推荐3】厨余垃圾中有机质含量高，利用微生物发酵技术将厨余垃圾变成绿色有机肥，可有效实现厨余垃圾无害化和资源化处理。某实验小组欲从厨余垃圾中筛选能高效降解淀粉的细菌，实验操作流程如图所示。回答下列问题：

(1)实验过程中对培养皿、烧杯等玻璃仪器常用_________法进行灭菌。在接种前，需要对厨余垃圾浸出液进行_________处理。根据X培养基上菌落的生长情况，推测该接种方法是________。
(2)在配制X培养基的组成成分时，加入的唯一碳源是淀粉，目的是___________。培养、加入碘液后，部分菌落周围出现清晰区，图中能最高效降解淀粉的细菌是__________（填编号）。与X培养基相比，Y培养基在成分组成上的特点是____________。
(3)用来筛选淀粉分解菌的X、Y培养基含有KH₂PO₄和Na₂HPO₄，其作用有______________（答出2点）。
(4)若厨余垃圾中混入了抗生素，将不利于其生物降解，为了筛选出对抗生素有抗性、能高效降解淀粉的细菌，在上图所示的基础上，对实验操作的优化方案是____________。

【推荐1】根据有关微生物的知识，分析回答问题。
（1）当水体过于纯净时，硝化细菌会形成休眠体，这种休眠体被称为________。
（2）对于混有硝化细菌、蓝细菌和大肠杆菌的悬浮液，可利用选择性培养基进行微生物筛选。筛选硝化细菌的培养基成份包括__________________________________（供选：葡萄糖、纤维素、牛肉膏、（NH₄）₂SO₄、KNO₃、无机盐、琼脂、伊红-美蓝染料、H₂O），制备培养基时，灭菌与调pH值的先后顺序是_______________。
（3）如利用上述培养基筛选大肠杆菌菌落，则应另外添加的成份是_________，菌落特征为_______________________________。
（4）将采自养殖池中的水样1ml稀释100倍，然后吸取稀释后的水样1ml，接种于上述硝化细菌选择性培养基上培养，接种所使用的工具是___________。一段时间后观察菌落并计数，实验重复三次结果如图。该养殖池每毫升水含有硝化细菌_______个。

【推荐2】牛奶中富含蛋白质，长期饮用有助于增强体质，但牛奶同时也是多种疾病的传播载体。国家标准是每毫升牛奶中细菌数小于30 000个。以下是牛奶消毒及细菌检测实验。

（1）培养基中的蛋白胨可以为微生物主要提供________________（填两个），对培养基常采用________________法进行灭菌。
（2）图中步骤①称为________________消毒法。步骤②是________________，若想对初步筛选得到的目的菌进行纯化并计数，可采用的接种方法是________________。
（3）将接种后的培养基和作为对照的________________同时放入37 ℃恒温培养箱中，培养36小时。为避免培养基污染，需将培养皿呈________________状态放置。取出后统计各平板的菌落数，菌落数分别为 87、 85 和83，细菌数大约是________________/mL。

【推荐1】青霉素的产业化生产是发酵工程在医药领域的重要应用之一。利用产黄青霉菌生产青霉素的发酵工程流程如下图所示，回答下列问题：
   
(1)图中对产黄青霉菌分离纯化采用的方法是______，该方法也可以用来计数的原理是______。刚分离获得的菌种不能直接加入主发酵罐，而是先进行“母种培养”，“母种培养”的目的是______。
(2)“补料”是指补充培养基，其成分有：葡萄糖、磷酸二氢钠等，其中磷酸二氢钠的功能为______（写出两点）；发酵罐中葡萄糖浓度过高时抗生素合成酶的活性会降低，从而影响青霉素的合成，因此“补料”添加葡萄糖时易采用______方法。
(3)青霉菌生长的适宜温度是30℃左右，而分泌青霉素的适宜温度为：20℃左右，生产上对青霉素发酵罐的温度控制方式为______。待完全发酵结束后，可采用______等方法将产黄青霉菌从发酵液中分离出来。

【推荐3】利用枯草芽孢杆菌的发酵可以生产亮氨酸脱氢酶。在启动子和亮氨酸脱氢酶基因之间插入信号肽（SPY）基因并将重组质粒导入枯草芽孢杆菌构建工程菌，可提高亮氨酸脱氢酶的生产水平。重组质粒的构建如图所示，Kan^R为卡那霉素抗性基因，Amp^R为氨苄青霉素抗性基因，图中各限制酶切割产生的黏性末端不同。回答下列问题：
       
(1)该基因表达载体中除图中标注外，还应具有终止子、复制原点等结构。启动子是_______________识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA。Kan^R和Amp^R都为抗生素抗性基因，其作用是_______________。
(2)在构建该基因表达载体的过程中，为提高重组率及避免目的基因和质粒自身环化以及目的基因和质粒反向连接，具体操作是________________。
(3)可利用_______________反应体系扩增亮氨酸脱氢酶基因，该反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，其过程包括_______________、复性和延伸三步，其中延伸阶段需加入耐高温的DNA聚合酶，其作用是___________。
(4)将重组质粒导入枯草芽孢杆菌构建工程菌时，一般先用Ca²⁺处理枯草芽孢杆菌，目的是_______________。利用枯草芽孢杆菌在发酵罐中发酵生产亮氨酸脱氢酶时，要随时检测培养液中的_______________（答两点）等，以了解发酵进程，还要及时添加必需的营养组分，严格控制温度、pH和溶解氧等发酵条件。