1 . 研究人员利用最新基因编辑工具CRISPR/Cas9，成功敲除了比格犬的载脂蛋白E（APOE）基因，培育出动脉粥样硬化疾病模型犬“苹果”。利用“苹果”腹部皮肤体细胞作为样本，建立细胞系，取其细胞核注入比格犬去核卵母细胞中，形成早期胚胎后进行胚胎移植，得到了我国首只克隆犬“龙龙”。如图为克隆犬“龙龙”诞生的流程图，回答下列问题：

   

(1)CRISPR/Cas9系统是由Cas9蛋白和sgRNA构成的RNA-蛋白复合体，其中的_________负责识别并结合特定DNA序列，引导Cas9蛋白对目的基因进行编辑，在实践中发现该系统有时存在编辑对象出错而造成“脱靶”的现象，实验发现sgRNA的序列长短影响成功率，sgRNA序列越长脱靶率越_____________（填“高”或“低”）。
(2)取“苹果”的皮肤细胞，并进行体细胞建系。皮肤细胞在培养过程中，首先应保证其处于______________的环境，除了适宜的营养物质、温度等条件外，还需要一定的气体环境是____________。
(3)为了获得较多的卵母细胞，需要对供体实验比格犬注射_______________，获得的卵母细胞应在体外培养到_______________期。在对卵母细胞去核时，可采用的方法有________________________（至少答出两种）。
(4)克隆本质上是一种无性繁殖，该过程的最后一道工序是胚胎移植，其实质是________________。胚胎移植前，需对供、受体犬进行_____________处理，为供体胚胎移入受体提供相同的生理环境。重构胚通常需要发育到_____________阶段才能进行胚胎移植。

2 . CRISPR/Cas9基因编辑技术可以按照人们的意愿精准剪切、改变任意靶基因的遗传信息，从而达到基因定点敲除、插入、突变的目的。在该基因编辑技术中，sgRNA是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导Cas9切割与sgRNA配对的靶基因DNA序列。请回答下列问题：
(1)Cas9可准确切割与sgRNA配对的靶基因DNA序列，由此可见，Cas9在功能上属于______酶，该过程体现了酶具有______性；此外，Cas9可准确切割靶基因DNA序列还依赖于sgRNA与靶基因DNA序列之间的___________。
(2)sgRNA是人工合成的一段能与靶基因互补配对的特殊序列，由23个连续的碱基组成。研究发现，sgRNA有时会出现脱靶问题，试分析其原因可能是________；解决措施是_________。
(3)为了实现某基因的特异性敲除，如图1所示，科学家将含有3个不同的但靶向相同基因的sgRNA编码基因的重组质粒组装到具有特殊元件的载体上，形成新的重组质粒。

注：eflap是能够驱动基因广泛表达的启动子；EGFP是增强型绿色荧光蛋白基因；I-SecI是归位内切酶，可将质粒随机插入目标生物的基因组中。
理论上，一个sgRNA便能实现靶基因的敲除，请分析构建图1所示重组质粒的优势：____________(答出两点)。
(4)为筛选特定D基因“敲除”的果蝇，在D基因的DNA断裂位点插入绿色荧光蛋白基因(EGFP)需构建携带有绿色荧光蛋白基因的供体质粒。把EGFP基因和His标签基因(His标签由6个组氨酸组成)连接起来构建融合基因并构建重组质粒，图2为载体、EGFP基因的结构、不同限制酶的识别序列及切割位点，欲将标签基因连接在绿色荧光蛋白基因(EGFP)编码区的首端，已知组氨酸的密码子为CAU，起始密码子为AUG。

①写出His基因模板链的碱基序列：5'-___________________________-3'。
②为构建融合基因并将其插入载体科研人员设计了一对与EGFP基因编码区两端序列互补配对的引物，设计时需在引物_______(填“A”或“B”)的5'端增加相应的限制酶识别序列和His基因的编码序列，请写出该引物开头的12个碱基序列：5'-_________-3'。

3 . 农作物在盐碱胁迫下产生过量的H₂O₂会破坏细胞结构，导致减产或植株死亡。某农作物可通过AT1蛋白调节细胞膜上PIP2s蛋白的磷酸化水平，影响H₂O₂的跨膜转运，作用机理如图所示。回答下列问题：
   
(1)PIP2s蛋白也可作为水通道蛋白，其转运水分子的方式属于____。
(2)据图可知，AT1蛋白与Cβ蛋白（细胞生命活动的必需蛋白）结合后，PIP2s蛋白磷酸化水平______（填“升高”、“降低”或“不变”），进而______（填“促进”或“抑制”）H₂O₂外排，导致细胞抗氧化胁迫能力减弱，最终死亡。
(3)已知CRISPR/Cas9基因组编辑技术可以实现基因的敲入和敲除。为提高盐碱地农作物粮食产量，请综合上述信息，尝试利用基因工程技术提出一条培育耐盐碱农作物的方法并解释其原因______。
(4)另有研究发现，对盐碱地中生长的某农作物施用药物X，一段时间后测得细胞内多糖与可溶性糖的比例发生改变，试推测药物X能提高农作物的吸水能力从而耐盐碱的原因是___。

5 . CRISPR相关基因位于细菌中。当外源DNA入侵细菌时，细菌将其作为新的“间隔序列”整合到自己的基因组中，从而使CRISPR相关基因能“记住”攻击过自己的外源基因，当再次遇到该外源基因时能对其进行识别、定位和剪切，以达到保护自身的目的。相关作用过程如图所示，其中crRNA为CRISPR相关基因的转录产物，其与Cas酶结合就能起到基因剪辑的作用。回答下列问题：

(1)在细菌获取新的间隔序列后，CRISPR相关基因通过转录形成crRNA链，与Cas酶形成crRNA-Cas复合物，当再次遇到相同外源DNA时，crRNA所起的作用是_______________，Cas酶起到_____________的作用。
(2)视网膜上包括视杆细胞和视锥细胞。引起色素性视网膜炎的基因突变，首先会导致视杆细胞死亡，继而引起视锥细胞死亡，最终导致视网膜退化，眼睛失明。某实验室利用上述基因编辑技术和视网膜退化小鼠模型为实验材料开展相关实验，使模型小鼠的视杆细胞身份基因丧失功能，诱导视杆细胞获得视锥细胞特征，使之能够不受有害致病突变的影响。
①从DNA分子中获取模型小鼠的视杆细胞身份基因，需要使用的酶是_______，然后使用_______酶将视杆细胞身份基因与cas基因、CRISPR相关基因构建为重组载体。
②可使用________法将重组载体导入模型小鼠的受精卵中，然后使受精卵发育为小鼠。
③检测到小鼠的视网膜未退化，视觉得到改善，说明导入的重组CRISPR相关基因________，使视杆细胞不被引起色素性视网膜炎的基因突变所影响，不发生死亡。

6 . CCR5是HIV入侵机体细胞的主要辅助受体之一，某科学家通过基因编辑技术关闭CCR5基因，欲使基因编辑婴儿天生能抵抗艾滋病病毒的感染。基因编辑技术通过CRISPR/Cas9系统可人为选择DNA上的目标位点进行定点切割。回答下列问题：
(1)HIV入侵机体后，首先与靶细胞上的CD4受体结合，据此推测，_____细胞含有CD4受体比较多，是HIV攻击的主要细胞。若通过HIV抗体检测，某人的检查结果为阴性，他_____（填“有可能”或“不可能”）感染了HIV。
(2)动物细胞中没有编码Cas9的基因，可利用基因工程将其导入真核细胞中。在基因工程中的关键步骤是_____。可用_____方法将Cas9基因导入受体细胞。
(3)所谓关闭CCR5基因，其实就是敲掉CCR5基因上的32个碱基，从而使其发生_____，基因编辑技术与传统的基因工程相比，其优点是_____。
(4)有部分专家指出，通过基因编辑技术诞生的婴儿是否真的天生具有抗HIV能力，还不能完全确定，做出此判断的原因是_____。

8 . 已知生物体内有一种蛋白质（P），该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质（P₁）不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。
(1)利用PCR技术扩增目的基因时_______________知道基因的全部序列。在PCR体系中除了模板、原料外，还应加入_____________________________________________。
(2)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过_______________和_______________，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物功能进行鉴定。
(3)“CRISPR/Cas9”技术是目前常用改造DNA序列的一种方法，下图为向导RNA引导Cas9蛋白切割目标DNA示意图。其中Cas9蛋白是一种_______________酶。Cas9蛋白和特定的向导引导序列可利用_______________法导入到动物受精卵或干细胞中发挥基因编辑作用。

(4)经改造后的细胞，若想工业化大量制备蛋白质P₁，可利用_______________和_______________技术将改造细胞转化为即可产生P₁又能无限增殖的细胞，最后自培养液中可得到目的蛋白质。

10 . CRISPR/Cas9系统基因编辑是一种对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，其原理是由一个向导RNA（sgRNA）分子引导Cas9蛋白到一个特定的基因位点进行切割。受此机制启发，科学家们通过设计sgRNA中碱基的识别序列，即可人为选择DNA上的任一目标位点进行切割（见下图）。

（1）从CRISPR/Cas9系统作用示意图看，能够行使特异性识别DNA序列并切割特定位点功能的分子是___________，其类似于基因工程中__________的作用。
（2）CCR5基因是人体的正常基因，其编码的细胞膜通道蛋白CCR5是HIV入侵T淋巴细胞的主要辅助受体之一。科研人员依据_____________的部分序列设计sgRNA序列，导入骨髓_________细胞中，构建sgRNA-Cas9复合体，以实现对CCR5基因的定向切割，变异的CCR5蛋白无法装配到细胞膜上，即可有效阻止HIV侵染新分化生成的T淋巴细胞。试分析与上述过程最接近的现代生物科技是________________。
（3）CRISRP/Cas9基因编辑技术有时存在编辑对象出错而造成脱靶，实验发现sgRNA的序列越短脱靶率越高。试分析脱靶最可能的原因是____________________________。
（4）通过上述介绍，CRISPR/Cas9系统的基因编辑技术在______________等方面有广阔的应用前景。（至少答出两点）