1 . 基因工程技术在动物科学领域有广泛应用，其中嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）技术是一种新兴的免疫疗法，用于治疗某些癌症。简要流程是：先从患者体内分离出T细胞，利用基因工程技术将能识别肿瘤抗原的抗体基因与T细胞的受体基因拼接，再将拼接的基因导入T细胞，体外扩增后回输到患者体内。请回答下列问题：
(1)基因工程的核心步骤是______，该过程需要的工具酶是______。
(2)在目的基因的首端和尾端需分别加上启动子和终止子，启动子是______识别和结合部位，终止子则起到______的作用。为保证目的基因被顺利切割，限制酶切割位点应加在PCR引物的______（填“3”或“5”）端。
(3)简述CAR-T细胞免疫疗法相比传统化疗在治疗癌症时的优势：__________________。（至少答出两点）

2 . 质粒P含有氨苄青霉素抗性基因（Amp）和四环素抗性基因（Tet），外源DNA的插入会导致插入部位基因失活。重组人干扰素a-1b是我国第一个国内批准生产的基因工程药物。图K为利用质粒P和人干扰素基因构建基因表达载体P₁的示意图。回答下列问题：

   

限制酶	LocRV	SauSA 1	Banil 1
识别序列及切制位点

(1)在基因工程操作中，对用作载体的质粒和目的基因通常需要进行人工改造。图示操作过程中，科学家将过程①所获得的目的基因片段又进行了过程②的改造，即在目的基因片段两端各加上一段GATC序列。根据图K和表推断，用来切割质粒P的限制酶应选择__________，过程③用到的酶称为__________。成功导入P₁的受体菌落具有的抗药性特点为___________。
(2)基因工程操作步骤中的核心工作是__________，为了保证目的基因能够正常表达，在构建P₁时必须将目的基因插入___________之间。
(3)科学家最早就是利用基因工程方法在大肠杆菌和酵母菌细胞内获得了干扰素。利用大肠杆菌作为受体菌时，一般先用__________处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将P导入大肠杆菌细胞中，最后还需要经过__________以确定该操作是否成功。
(4)干扰素是淋巴细胞分泌的一类细胞因子，获取干扰素的传统方法是从人的白细胞中提取，但产量很低，利用基因工程定向改造大肠杆菌的遗传特性，再配合发酵工程技术即可规模化生产干扰素这种基因工程药物。利用发酵工程生产基因工程药物的优点有（写出一点即可）______________

3 . 基因递送是植物遗传改良的重要技术之一，我国多个实验室合作开发了一种新型基因递送系统（切—浸—生芽Cut-Dip-Budding，简称CDB法）。图1与图2分别是利用常规转化法和CDB法在某植物中递送基因的示意图：

回答下列问题。
(1)图1中，诱导愈伤组织期间一般不需要_____，从愈伤组织到幼苗的培养过程称为_____，启动这一过程的关键激素是_____。
(2)图1与图2中，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是_____。
(3)与常规转化法相比，采用CDB法进行基因递送的优点是_____（答出1点即可）。

4 . 植物缺铁可使抗氧化酶活性下降，引起磷脂分子发生过氧化反应，产生丙二醛（MDA）。现以盘菜幼苗为材料，进行正常供铁和缺铁处理20d，取顶端完全展开叶探讨缺铁对其光合色素、光合特性的影响。结果如下表所示。

处理	正常供铁（100μmol·L-1）	缺铁（0.1μmol·L-1）
净光合速率/（μmol·m-2·s-1）	15.4	6.26
叶绿素/（mg·g-1）	0.35	0.22
类胡萝卜素/（μmol·m-2·s-1）	0.2	0.22
光补偿点/（μmol·m-2·s-1）	20.9	25.3
气孔导度/（μmol·m-2·s-1）	0.18	0.11
胞间CO2浓度/（μmol·m-2·s-1）	224	284

(1)盘菜叶片中所含光合色素的功能是____。据题意分析，缺铁会导致盘菜幼苗净光合速率降低，原因是____，盘菜的光合效率下降主要是由，____（“气孔”或“非气孔”）因子引起的。
(2)据表分析：与正常盘菜幼苗相比，培养缺铁幼苗时，维持光合作用与呼吸作用平衡所需要的光照强度____（“较高”或“较低”），依据是____。
(3)S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAMS）可催化裙带菜体内某些激素的合成。研究发现，裙带菜受到缺铁胁迫时SAMS基因表达量增加，从而适应缺铁胁迫。请结合所学知识，写出快速获得大量抗缺铁盘菜的实验思路____。

5 . 植物细胞壁中存在大量不能被猪消化的多聚糖类物质，如半纤维多聚糖，果胶质（富含有半乳糖醛酸的多聚糖）等。研究人员通过基因工程，胚胎工程等技术培育出转多聚糖酶基因（manA）猪，主要流程如下图（neo为青霉素抗性基因），回答下列问题：

(1)通过①过程获得的重组质粒含有4.9kb个碱基对，其中manA基因含有1.8kb个碱基对。现将该重组质粒成功导入受体细胞后，经培养，发现约有50%的细胞能正常表达目的基因产物，原因是______。若用BamHI和EcoHI联合酶切割其中一种重组质粒，只能获得1.7kb和3.2kb两种DNA片段，若用上述联合酶切割同等长度的另一种重组质粒，则可获得______kb长度两种的DNA片段。
(2)在④过程的早期胚胎培养时，通常需要定期更换培养液，目的是______。移植前可以取囊胚的______细胞对早期胚胎进行性别鉴定。
(3)⑤过程前，通常需对供受体母猪进行______，使其生理状态相同。与普通猪相比，该转基因猪的优势是______

6 . 肝纤维化与肝细胞癌的发生密切相关。研究发现活化的人肝星状细胞会大量合成和分泌Ⅰ型胶原蛋白沉积在肝小叶的窦间隙，大量产生Ⅰ型胶原蛋白是肝星状细胞活化的标志之一。人Ⅰ型胶原蛋白由4条肽链组成，其中两条由COL1A1基因编码。为了建立能直观反映I型胶原蛋白表达量改变的细胞模型，本研究旨在通过基因工程技术构建人COL1A1和绿色荧光蛋白（EGFP）融合基因表达载体，并将其导入到LX-2细胞（永生化的人肝星状细胞）中，为抗纤维化药物研发建立可视化的报告系统。

(1)研究过程中，应将LX-2细胞置于含______的气体条件下培养。
(2)在构建基因表达载体过程中，所需要的工具酶有______（请写出2点）；其中Kozak序列能增强EGFP基因的表达，已知EGFP基因的α链为转录的模板链，则应将图2中EGFP基因的______（“A”或“B”）端与Kozak序列连接。
(3)已知LX-2细胞可被细胞因子TGF-β1活化，激活COL1A1基因表达，成为肝纤维化研究常见的细胞模型。科学家为验证LX-2细胞能通过EGFP表达来反映表达COL1A1能力的改变，进而筛选抗纤维化药物。对实验进行了分组处理，对照组为无诱导处理的LX-2细胞，模型组为______，实验组为______（实验材料：LX-2细胞、TGF-β1、已知具有潜在抗肝纤维化作用的药物青蒿琥酯）。实验结束后，检测各组LX-2细胞荧光强度和相关基因（COL1A1和EGFP）的表达水平，二者相互印证。若实验组的荧光强度均低于模型组的荧光强度，实验结果说明______。

7 . 玉米中含有β-胡萝卜素，为培育出含β-胡萝卜素的“黄金大米”，科研人员提出以下两套培育方案。请分析回答下列问题。

(1)甲方案中，β-胡萝卜素基因能在玉米和水稻体内出现相同表达结果的原因是___。
(2)通过⑤获得“黄金大米”幼苗过程中，植物需要依赖培养基中的蔗糖，其中蔗糖的作用是___（请至少答出两点）。
(3)乙方案中，在体细胞杂交前需要用___酶除去细胞壁获得原生质体，获得原生质体后，将其置于___溶液中防止其吸水涨破。常用化学试剂____________诱导原生质体的融合。
(4)甲乙两方案在育种工作中都具有广泛的应用价值，两者共有的优点是___。

8 . 防御素是一类富含二硫键的阳离子型多肽，广泛分布于真菌、植物与动物中，是生物免疫系统中的重要调节分子。β-防御素是一种由H基因编码的抗菌肽，抑菌谱广。长春生物科技研究所通过构建重组酵母菌进行发酵，获得了β-防御素。回答下列问题：
(1)为获得β-防御素基因，研究者利用致病细菌的脂多糖（LPS）刺激结肠癌细胞株提高β-防御素的表达量，提取总RNA，经过___________后，作为模板进行PCR扩增。PCR产物常采用___________来鉴定，鉴定后进行测序。测序结果与____________数据库中的公开数据进行比较，进而得到正确的β-防御素基因。
(2)本实验选用毕赤酵母表达载体pPIC9K（如图），扩增目的基因时设计的1对引物为P1（5'ATCGAATTCATGGGAAGTCATAAACACATTAGA3'）和P2（5'TATAGCGGCCGCCTATTTCTTTCTTCGGCAGCAT3'）。

①本实验中引物的作用是__________（答出2点即可）；
②部分限制酶识别序列及切点如下表，结合图中限制酶切点与引物，推测本实验酶切时，选用的两种限制酶是____________，采用双酶切法的优势是_________（答出2点即可）。

限制酶	识别序列及酶切位点
Bg! Il	5..A↓GATCT...3'
EcoR I .	5...G↓MTTC...3'
SnaB 1	S.'.TAC↓GTA..3'
Sac	5..-GAGAC↓C--.3'
Avr lI	5..C↓CTC...3'
SulI	G↓TCCGAC...
Not I	5.. CC↓GGGCCGC...3

(3)毕赤酵母表达系统最大的优点是可对β-防御素__________（答出2点即可），直接表达出具有生物活性的产品。
(4)毕赤酵母表达系统发酵结束后，采取适当的___________措施来获得产品。

9 . 基因工程在医药卫生领域的应用

分类	实例	处理或作用
转基因动物________	________(乳房生物反应器)	将药用蛋白基因与________的基因的启动子等调控元件重组在一起。
转基因动物作________	克隆猪器官	抑制或除去________决定基因，结合克隆技术培育出没有________的转基因克隆猪器官。
基因治疗	镰状细胞贫血的治疗方案	基因治疗的策略主要有基因置换、________等。

10 . 人β防御素是一种由H基因编码的抗菌肽，抑菌谱广，可通过构建重组酵母菌及其发酵实现量产。
(1)本实验选用毕赤酵母表达载体pPIC9K（如图甲所示），扩增目的基因时设计的一对引物（P1和P2）如图丙所示。

①本实验中引物的作用是___。
②结合载体与引物，推测本实验中采用的一对限制酶是___。
(2)毕赤酵母真核表达系统最大的优点在于该体系可对目的蛋白___，直接表达出具有生物活性的蛋白。
(3)重组毕赤酵母合成的β防御素在面包制作中还具有局限性。因β防御素的糖链结构与哺乳动物糖蛋白链结构的差异存在抗原性，作为防腐剂添加，有引起机体免疫反应造成过敏的危险。请结合已有的基因工程和蛋白质工程知识给出改良思路去除上述β防御素的糖链结构：___。
(4)工业化发酵生产β防御素的过程一般包括菌种的选育，扩大培养、___、接种、发酵、产品的分离、提纯等方面，将β防御素工程菌接种至发酵罐内进行扩增，培养过程中可定期取样并使用细菌计数板对___（填“菌体”或“菌落”）进行直接计数，以评估增殖情况。发酵结束后，采用___（答出2点）等方法获得所需的发酵产品。