21. 研究者利用基因组编辑技术,将Bcl-2(抗凋亡)基因定点敲入FUT8(岩藻糖转移酶)基因,从而改造中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
(1)Cas9蛋白和sgRNA是基因组编辑工具(图1),为筛选进行高效编辑的sgRNA,需根据
______基因相应序列,设计并合成多个sgRNA链。分别构建sgRNA/Cas9表达质粒,并通过
_______法导入CHO细胞。
(2)Cas9蛋白与靶序列结合并将DNA双链切断,随后细胞会通过DNA损伤修复机制,将断裂处两端的序列连接起来,但在缺口处会发生碱基错配。T酶能特异性识别并切割错配的双链DNA,通过T酶的酶切实验检测sgRNA在CHO细胞内编辑效率。对图2电泳结果分析,
______组实现sgRNA的高效编辑。
(3)将含目的基因表达框和sgRNA/Cas9表达质粒(1:1)共转染CHO细胞,实现同步敲入敲除基因,具体过程如图3.
①目的基因表达框中含基因表达所需的元件,元件顺序依次为:同源序列I-
_________同源序列Ⅱ,
_______元件导致FUT8基因靶点后序列没有成功转录。(填选项)
a、T2A(连接子)b、启动子
c、转录终止信号
d、Bcl-2基因
e、FUT8基因 f、绿色荧光蛋白基因
②选取具有
_______特征的细胞,进一步提取基因组DNA,并对图3中片段
______进行PCR,筛选出在FUT8靶基因处成功整合目的基因表达框的单克隆细胞。若PCR扩增产物的电泳结果出现
______,表明筛选出的单克隆细胞为成功定点整合的纯合细胞。
(4)CHO细胞是基因工程中生产抗体的常用受体细胞,FUT8负责将岩藻糖转移至表达抗体上,而岩藻糖的存在会极大地降低抗体的作用。请分析利用改造后的CHO细胞株进行抗体生产的优势
_______。