【推荐1】人的血清蛋白（HSA）具有重要的医用价值，研究人员欲用乳腺生物反应器来大量生产HSA。下图所示为HSA基因片段和人工构建的大肠杆菌质粒pBR322，图中Amp^r表示氨苄青霉素抗性基因，Neo^r表示新霉素抗性基因，箭头表示切割形成末端完全不同的4种限制酶的切割位点。请据图回答问题：

(1)人工构建pBR322质粒除了含特定限制酶切割位点、标记基因、复制原点外，还必须有__________（答出两点）等。
(2)若选用牛作为受体动物，可将人血清蛋白基因与_________等调控组件重组在一起，通过_________方法将目的基因导入牛的受精卵中，然后使其发育成转基因牛。
(3)据图分析，在构建基因表达载体时，选择____________作为切割质粒和目的基因的限制酶可提高目的基因和载体的正确连接效率，其原因是_________。
(4)为了排除普通受体细胞（未导入质粒）、空质粒受体细胞（导入pBR322质粒而非重组质粒）的干扰，目的基因导入后，进行了进一步筛选：制备甲、乙两种培养基，甲培养基含新霉素，乙培养基含新霉素和氨苄青霉素。含重组质粒的受体细胞在甲培养基上___________（填“能”或“不能”）生存，在乙培养基上___________（填“能”或“不能”）生存。
(5)据下图分析，利用PCR技术获取HSA基因时，应选择甲、乙、丙、丁四种引物中的_________﹔若扩增4次，共需要引物__________个。

【推荐2】在含有X-gal和IPTG物质的培养基上，大肠杆菌质粒上的lacZ^‘基因如表达出产物β-半乳糖苷酶，则能使菌落呈现蓝色，否则菌落呈现白色。基因工程中常利用该原理从导入质粒的受体细胞中筛选出真正导入重组质粒的细胞。^’请据图回答：

（1）限制酶EcoRI的识别序列和酶切位点是-G↓,AATTC-，SmaI的识别序列和酶切位点是-CCC↓GGG-，图中目的基因被切割下来和质粒连接之前，需在目的基因的右侧连接相应的末端，连接的末端序列是______________。限制酶EcoRI在质粒上的酶切位点在lacZ^‘基因中，故该基因工程中，lacZ^‘基因的作用为_____________基因。
（2）获取目的基因后，常利用__________技术在体外将其大量扩增，此过程需要一种特殊的酶叫______。
（3）转化过程中，大肠杆菌应先用_____________处理，使其成为_________________细胞。
（4）颜色为白色的是含有目的基因的菌落，原因是____________。

【推荐3】土壤盐渍化影响水稻生长发育。将水稻耐盐碱基因 OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育耐盐碱水稻新品种，其操作流程及可能用到的限制酶如图，其中bar为抗除草剂基因，Tet^r为四环素抗性基因，Amp^r为氨苄青霉素抗性基因，①~⑦表示操作过程。

限制酶	BamHⅠ	BclⅠ	SmaⅠ	Sau3AⅠ
识别位点及切割位点	-G↓GATCC-	-T ↓GATCA-	-CCC↓GGG-	-↓GATC-

(1)过程①PCR扩增 OsMYB56需要添加引物，应选用的引物组合为_____

A．5′-CTTGGATGAT-3′和5′-TCTGTTGAAT-3′

B．5′-CTTGGATGAT-3′和5′-TAAGTTGTCT -3′

C．5′-ATTCAACAGA -3′和5′-ATCATCCAAG-3′

D．5′-ATTCAACAGA-3′和5′-GAACCTACTA-3′

(2)根据基因表达载体的结构组成分析，Ti质粒中的CaMV35S是_______。其功能是______。
(3)过程③应选用______切割质粒，利用所选限制酶进行操作的优势是________。切割后需要用________进行连接才能获得重组质粒。
(4)为了筛选出含重组质粒的受体细胞，应在添加________的选择培养基上培养。培养后获得的菌落不能判定是否含有重组质粒，原因是_______。

【推荐1】回答下列（一）、（二）题：
（一） 回答下列有关生物技术实践的问题：
（1）尿素固体培养基在高压蒸汽灭菌时压强需要适当降低的原因是_______________。
（2）“分离以尿素为唯一氮源的微生物”实验中，在无菌条件下，将 1g土样加到含有 99 ml _____的三角瓶中，振荡 10min，即成10^-2土壤稀释液。逐步稀释制备10^-3、10^-4、10^-5 土壤稀释液，取10^-4和10^-5的土壤稀释液各0.1ml，分别用_____法接种到LB培养基和尿素培养基中，倒置培养后，观察到尿素培养基上周围出现_____，若 10^-5三个尿素培养基中分别有32、35、38个这样的菌落，则1g土壤中含分解尿素的菌体数为_____个。
（3）制作苹果酒的过程中，在榨苹果果汁时，为提高出汁率，通常可使用_________________________处理。气温高的夏天，制作成功的苹果果酒若暴露在空气中酒味会逐渐消失而出现醋酸味，原因是_________________________。
（4）在“固相淀粉酶水解淀粉的鉴定”实验中，可通过对照实验来确定糊精的产生，一组为淀粉溶液+指示剂：呈蓝色；一组为_______________+指示剂：呈红色。
（5）为筛选胞外α–淀粉酶分泌型菌种，可以从米酒厂周围获得土样，原因是_______________。
（二）回答下列有关现代生物技术的问题：
（1）新型冠状病毒是单链 RNA 病毒，我国科学家在新冠病毒肺炎出现后很快就测定出了新冠病毒的核酸序列，科学家首先进行__________获得了病毒蛋白对应的DNA 片段，然后借于PCR技术使该DNA片段大量扩增。再将其与运载体结合成重组DNA，而构建重组DNA需要的酶是_______________。
（2）在体外培养动物细胞时，培养液中要加入促生长因子、无机盐、微量元素、糖、氨基酸、动物血清等成分，放在__________中进行培养。
（3）通过抗病性强的植株获取抗病目的基因有多种方法。现已获得纯度高的抗病蛋白（可作为抗原），可通过__________技术获得特异性探针，从而获得目的基因。
（4）植物细胞在培养过程中往往会发生变异，可利用这一特性筛选抗致病真菌能力强的细胞。筛选时在培养基中加入__________，并将存活的细胞进一步培养至再生植株。
（5）图中②过程可用化学诱导剂、灭活的仙台病毒或在__________诱导下完成。

【推荐2】为研究干旱胁迫基因LEA和VOC对甘蓝型油菜油脂的积累机制，科研人员构建了两个基因表达载体。其中基因LEA与荧光素酶基因（Luc）构建成基因表达载体甲，基因VOC和标记基因构建成基因表达载体乙，相关序列及酶切位点如图所示。

(1)利用PCR扩增LEA基因时，需要在反应体系中添加的有机物质有引物、模板、___________还需要在引物的___________（填“3´端”或“5´端”）添加限制酶识别序列，添加序列对应的限制酶是___________，选择上述酶的依据是___________。
(2)为了构建基因表达载体甲，依据图中已知碱基序列，在PCR扩增仪中加入的引物的碱基序列为_________，扩增_____________代后会得到等长的8条DNA片段。
(3)农杆菌转化甘蓝型油菜细胞时，T-DNA的作用是___________，该过程发生的变异类型为___________
(4)乙酰-CoA羧化酶基因（AC）是油脂合成过程的关键酶基因，甘油三酯酯酶基因（ATGL）是油脂分解过程的关键酶基因。将基因表达载体甲、乙分别导入植物细胞培养成转基因植物A、B，在干旱胁迫的环境下培养两种转基因植物和正常植物，分别检测植物体内AC和ATGL基因的表达水平，结果如下图。

①在分子水平上，用____________方法检测AC酶和ATGL酶的含量可得到上述结果。
②基于以上研究，干旱胁迫基因LEA和VOC在甘蓝型油菜油脂积累中的机制是___________。

【推荐3】基因表达载体的构建是基因工程的核心。图中甲为限制酶EcoRI的识别序列，图乙表示目的基因及限制酶切点，图丙表示目的基因上的DNA片段，图丁表示质粒。请回答下列问题：

（1）从供体真核生物的某组织中获取mRNA，并以此为模板反转录产生多种片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，该受体菌群体叫_____________文库，从该文库中获得的目的基因_____________（填“含”或“不含”）启动子、终止子、内含子。
（2）若用图甲所示的限制酶EcoRI切割外源DNA，就其专一性而言，切开的是G和A所在的两个核苷酸之间的_____________键，即图丙的_____________处。
（3）为了使目的基因和质粒定向连接，并且有利于受体细胞的筛选，提高重组效率，应该选择的限制酶是PstI和_____________，如果大肠杆菌是受体细胞，则其体内应不含_____________基因，以利于筛选出含质粒的受体菌。
（4）PCR技术扩增图乙中的目的基因时，需要提供模板、dNTP、_____________、引物A和引物___________等条件。

【推荐1】径柳匙叶草是一种泌盐植物。科研工作者将径柳匙叶草液泡膜Na⁺/K⁺逆向转运蛋白基因（TaNHX2基因）转移到棉花细胞内，获得了转基因耐盐棉花新品种。图1是获取的含有目的基因的DNA片段，Sau3AI、EcoRI、BamHI为三种限制酶，图中箭头所指为三种限制酶的切点；图2是三种限制酶的识别序列与酶切位点示意图；图3是土壤农杆菌中用于携带目的基因的Ti质粒结构示意图，请分析回答问题：

(1)将含有径柳匙叶草不同基因的DNA片段导入受体菌的群体中储存，再根据TaNHX2基因的特定核苷酸序列从中提取图1的片段，此法为从___中获取目的基因。
(2)不能在径柳匙叶草根尖分生区细胞中获得TaNHX2基因的mRNA，其原因是___。
(3)若用BamHI切割图1所示的DNA片段，获得目的基因，则需选用___切割图3所示质粒，以便构建基因表达载体，该方案的缺陷是___。故切割图1所示DNA片段的最佳方案是选用___酶。
(4)为了检测技术成果，科研工作者在个体水平的检测方法是___。

【推荐2】以下是采用不同方法培育良种牛的过程，请据图回答下列有关问题：

(1)②过程使用________________酶，③表示______________技术，该技术的条件是原料、能量___。④表示基因工程中__________过程，目的是___________________。
(2)如果要人工控制牛的性别，可采用________________技术，对早期胚胎进行性别鉴定，可以取________________细胞进行DNA分析，所使用的基因探针来自__________染色体。
(3)如果转基因牛D的牛奶中含有_____________，则说明该基因在个体水平已表达成功，其他细胞中不含血清白蛋白是_______________________的结果。

【推荐3】SRY基因是哺乳动物Y染色体上具有决定雄性性别作用的基因片段。某人的性染色体组成为XX，但表现为男性体征，调查发现其1条X染色体上带有Y染色体的DNA片段。回答下列相关问题：
(1)在确定该DNA片段中是否含有SRY基因时，先从被测试者细胞中是取该DNA片段，然后和引物（根据SRY基因设计的一段碱基序列）混合，进行PCR扩增；在PCR的延伸阶段，需加热至70～75℃，主要依据 _________和 _____________因素考虑。最后，用 _____________________作为探针对扩增产物进行检测，若出现阳性反应，则 ____________（填“含有”或“不含有”）SRY基因。
(2)为验证该DNA片段能否决定雄性性别，将含该DNA片段的基因表达载体导入小鼠体内。一种操作方法是将目的基因导入雄原核，而不是雌原核，过程见如图所示，从两者形态差异上分析，主要原因是 ____________________________。

(3)为筛选出性染色体组成为XX的小鼠胚胎，可对 ___________时期胚胎的滋养层细胞进行鉴别。将符合条件的早期胚胎移入代孕母鼠子宫中，胚胎移植时代孕母鼠的选择条件是 _____________（写出2项即可），代孕母鼠对移入子宫的外来胚胎基本不发生 _____________，这为胚胎在代孕母鼠子宫内的存活提供了可能。在获得的子代小鼠中出现 ________________（性别）小鼠，证明该DNA片段含SRY基因。

【推荐1】下图1、2分别是单克隆抗体制备过程和克隆羊培育过程示意图，请据图回答下列问题：

(1)图1和图2所示的过程中，都必须用到的动物细胞工程技术手段是__________________。
(2)获取小鼠新鲜的骨髓瘤组织，在37℃下用________________消化30-40分钟形成分散细胞。
(3)图1中②过程常在_____________(生物法)诱导下完成，两两融合形成的细胞共有______种，所以需要利用__________培养基筛选出既能无限增殖又能分泌抗体的___________细胞。单克隆抗体与常规的血清抗体相比，最大的优越性是__________________________________________。
(4)图2 克隆羊“多莉”从理论上证明了___________________；若不考虑变异及环境因素的影响，亲代和其克隆子代性状_________(填“是”或“不是”)完全相同的，原因是______________。

【推荐2】现代生物技术的发展，人们对细胞有了更多的认识，回答下列问题：
（1）胚胎干细胞在基础生物学、畜牧学和医学上具有十分重要的应用价值。囊胚期胚胎由_________________、囊胚腔和滋养层组成。前者将产生胚胎的所有组织和胚外结构，后者形成胎盘。首先用免疫外科方法去掉囊胚外围的滋养外胚层， 再将得到的细胞平铺于_________细胞上以防止分化，在高血清浓度条件下培养数天后，ES集落开始形成，大约每隔7d 进行分散和重新平铺，分散的方法可以是微吸管机械分散，也可以用_______________消化分散。目前已得到未分化状态、具正常双倍体核型及多向分化潜能的干细胞，已传三十多代并可____________保存。
（2）Weiss等用细胞融合实验证明，分化的细胞中存在“闲置不用”的结构基因。他们把大鼠肝肿瘤细胞和小鼠成纤维细胞融合成_________细胞，筛选出含有两套肝细胞染色体和一套成纤维细胞染色体的细胞。这些细胞既保持了合成_______________细胞3种特异蛋白的能力，也合成了小鼠肝细胞的这3种蛋白，但是在正常的成纤维细胞中从不合成这些。由此可见，融合实验证实了小鼠成纤维细胞_______________。
（3）由于细胞体积小，要通过显微操作装置在显微镜下进行解剖手术和微量注射。显微操作技术可用于_________、_____________ 等技术。

【推荐3】细胞工程是细胞生物学理论与现代工程技术相结合，综合应用于农业、医药及食品等领域的科学技术。细胞工程技术的迅速发展，越来越深远地影响着人们的生活。
(1)甘蔗是喜温作物，甘蔗新台糖22号（ROC22）具有高产高糖等优良特性但耐寒性差，桂糖28号（GT28）是耐寒品种，用ROC22和GT28进行体细胞融合，可望获得耐寒性更强且农艺性状优良的杂交后代。下图为培育过程示意图，请分析回答：

①运用体细胞融合技术培育出ROC22和GT28的杂交后代过程中，所运用的生物学原理有________________。
②过程a所需的酶是________，细胞融合完成的标志是________。
③过程d所用培养基中，含有植物激素X和Y，逐渐改变培养基中这两种植物激素的浓度比，未分化细胞群的变化情况如图所示。植物激素X是________。

(2)我国中科院的研究团队利用细胞工程和基因编辑技术，成功培育出世界上首例只有双母亲来源的孤雌小鼠和双父亲来源的孤雄小鼠，实现了哺乳动物的同性繁殖。实验流程如下图所示，请分析回答：

①体外培养动物细胞时，首先应保证其处于_______的环境，除了适宜的营养物质、温度等条件外，还需要控制的气体条件是________。
②要培育孤雄小鼠需要将精子和具卵细胞细胞核特点的ahESC同时注入去核的卵母细胞形成重构胚，此卵母细胞应在体外培养到________期，得到的重构胚通常需要发育到________阶段才能进行胚胎移植。
③利用________的方法对乙进行处理得到了多只孤雄小鼠，请从遗传物质角度分析，利用这些孤雄小鼠作为实验材料进行医学研究的优点是________________________________________。