1 . 在分离、纯化大肠杆菌实验中，划线接种（图1）、培养结果（图2）如下图。有关叙述错误的是（       ）

A．接种前应对培养基进行高压蒸汽灭菌

B．连续划线的目的是获得单个细菌形成的菌落

C．接种过程中至少需要对接种环灼烧5次

D．图1中a区域为划线的起始位置

2 . （一）回答与植物组织培养和对微生物的筛选、培养有关的问题：
(1)首先配置MS培养基。经高压蒸汽灭菌后培养基pH会变化，故灭菌前培养基pH__________目标值。如何判断灭菌后的培养瓶中培养基的灭菌效果__________。
(2)目前世界各国受病毒侵染的植物极多，应用植物组织培养技术获得无毒植株，进一步扩繁应用于生产，是目前最有效的防治病毒的方法。植物部位的选取是脱毒苗培育的关键，一般选取__________。无毒苗可通过组织培养的方法快速繁殖，主要通过愈伤组织和丛状苗的方式。愈伤组织的成功诱导取决于___________（从两个方面回答）。形成从状苗后一般需要分株后移入生根培养基中，需要分株的原因是__________。
(3)为了获得大量能产乳糖酶的微生物L，先挑取单菌落在液体培养基中培养，而此过程需要震荡的原因是__________。培养一段时间后，利用平板计数时，需每隔一个“时间间隔”统计一次菌落数，最后选取稳定时的菌落数作为记录结果，这样可以避免__________，导致统计结果偏小。
（二）采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉（Cd）在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内，进行后续处理（例如，收集植物组织器官异地妥善储存），可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd转运蛋白（YCF1）基因导入受试植物，并检测了相关指标。回答下列问题：
(4)为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体称为该种酵母菌的__________。
(5)将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需要的工具酶是__________。构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因，其作用是__________。
(6)进行前期研究时，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，常用的方法是__________。研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系，采用不育株系作为实验材料的目的是__________。
(7)将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中，半年后测定植株干重（图1）及不同器官中Cd含量（图2）。据图1可知，与野生型比，转基因植株对Cd具有更强的__________（填“耐性”或“富集能力”）；据图2可知，对转基因植株的__________进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。

(8)已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析，转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境的原因是__________有利于植株吸水。

3 . I、乳酸菌数量是评价活性乳酸菌制品质量的重要指标。研究小组用具有乳酸菌筛选功能的MRS培养基对某品牌酸奶中乳酸菌数进行研究。将乳酸菌专用MRS培养基倒平板，每个平板接入0．1 mL酸奶样品的稀释菌液，涂布均匀。回答下列问题：
(1)为防止杂菌污染需要对培养基进行高压蒸汽灭菌，灭菌是指_____。
(2)梯度稀释时，应用_____对酸奶进行稀释。若要将样品稀释10倍，可用无菌移液管吸取5 mL酸奶样品加入盛有_____mL稀释液的三角瓶中充分混匀。
(3)平板接种后需对培养皿进行处理，再放置在培养箱中37℃恒温培养。该小组设计三种不同的处理方案：①将培养皿置于点燃蜡烛的密闭容器内，待蜡烛熄灭后将密闭容器放入培养箱；②将培养皿直接置于密闭容器内后放置在培养箱中；③培养皿不做处理直接放置在培养箱中。为能更真实反映样品中的乳酸菌数量，应选择的处理方案是_____（填序号），理由是_____。
II、如图所示为血红蛋白提取和分离的部分装置，回答下列问题。

(4)在进行第一步样品处理时首先要对红细胞进行洗涤，目的是_____，以利于后续步骤的分离纯化。红细胞破碎后，通过_____法将血红蛋白从混合液中分离出来，图甲所示为分离结果，其中_____（填数字标号）是红色透明的血红蛋白水溶液。
(5)图乙装置可用于第二步_____过程，即透析12小时。
(6)通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经_____进行纯度鉴定。

4 . 自生固氮菌是土壤中能独立固定空气中N₂的细菌，将玉米种子用自生固氮菌拌种后播种，可显著提高产量并降低化肥的使用量。科研人员进行了土壤中自生固氮菌的分离和固氮能力测定的研究，部分实验流程如下图。请回答下列问题：

(1)步骤①土样应取自当地_____（填“表层”或“深层”）土壤；步骤②需充分振荡20 min，主要目的是_____；步骤③将土壤悬浮液稀释了_____倍。
(2)下列为两种培养基的配方，步骤④应选其中的_____培养基，并加入琼脂后进行高压蒸汽灭菌、倒平板。纯化培养时，需同时进行未接种培养基的培养，目的是_____。
Ashby培养基：甘露醇（C₆H₁₄O₆） 10 g，KH₂PO₄ 0．2 g，MgSO₄·7H₂O 0．2 g，NaCl 0．2 g，K₂ SO₄ 0．3 g，CaCO₃ 5 g，蒸馏水1 000 mL。
LB培养基：蛋白胨10 g，酵母膏5g，NaCl 10 g，蒸馏水1000 mL，pH 7．0～7．2．
(3)将纯化的固氮菌置于完全培养液中扩大培养48 h，经离心后收集下层细胞并转移至箱定培养基中进行固氮能力的测定，筛选出固氮能力最强的菌种CM12，为进一步鉴定其固氮能力，科研人员选用发芽一致的玉米种子进行3组盆栽实验，30 d后测定土壤微生物有机氮含量，结果如下图。

N：尿素处理组[每盆土壤中浇灌50 mL有氮全营养液（在1000 mL无氮植物营养液中加入0．12 g尿素）]；CM12：自生固氮菌CM12处理组（每盆土壤浇灌50 mL接种自身固氮菌的无氮植物营养液）。
①对照组（CK）的处理为_____。
②实验结果表明，用尿素处理和接种固氮菌CM12处理均能显著增加土壤微生物有机氮含量。与尿素处理组相比，CM12处理组土壤微生物有机氮含量增加了约_____（保留l位小数）%。
③自生固氮菌较共生固氮菌（如根瘤菌）的应用范围更广，原因是_____。

5 . 测定水样是否符合饮用水卫生标准，常用滤膜法测定大肠杆菌的数目。流程如图所示，滤膜法的大致流程：用滤膜过滤待测水样→水样中的细菌留在滤膜上→将滤膜转移到伊红美蓝的培养基（EMB培养基）上培养→统计菌落数目。据图回答问题：

(1)过滤待测水样用到的滤杯、滤膜和滤瓶首先需要进行消毒灭菌处理，保证实验不受其它微生物干扰。与过滤有关的操作都要在___________________旁进行。
(2)将完成过滤之后的滤膜紧贴在EMB培养基上，这属于微生物培养中的_______________操作。从物理状态角度分析，EMB培养基属于_______________培养基，制备培养基时需要采用_______________法灭菌。
(3)某生物兴趣小组的某同学尝试按照上述方法进行测定，无菌操作下将10ml待测水样加入到90ml无菌水中，稀释后的100ml菌液通过滤膜法测得EMB培养基上的菌落数平均为124，黑色菌落数平均为31，则推测1升待测水样中的大肠杆菌数目为___________________个。
(4)该同学进一步思考，利用滤膜法也可能用于测定待测水样中其他微生物的数目。他取了两份水样，一份待测水样来自变酸的果酒，从中检测到两种微生物，它们在结构上的主要区别是___________________。另一份来自某公园的观赏湖，若要通过测量蓝细菌的数目来研究水华，培养基配方中则必需添加___________________（水、无机盐、碳源、氮源）。

6 . 乳酸菌常用于制作酸奶、泡菜等发酵食品。某研究小组对乳酸菌的分离、培养及其抗药性进行相关的研究，回答下列问题：

(1)在分离、培养乳酸菌时配制培养基必须加入_____四类主要的营养物质。对培养基进行灭菌的常用方法是_____ 。
(2)接种微生物的方法有很多，图中的接种方法为_____。用该方法统计样本菌落数后求出平均值，所得数据需要乘以10ⁿ后，才可表示乳酸菌的数量（单位：个/L），这里的n=_____。
(3)研究小组为了检测某品牌酸奶中乳酸菌对青霉素、四环素的耐药性，进行了如下实验，请完善实验操作步骤：
步骤1：取三组培养基编号，分别加入_____。
步骤2：向三组培养基中分别接种等量待检测的乳酸菌菌种。
步骤3：将接种后的三组培养基和一个未接种的培养基都置于适宜温度等条件下培养一定时间，观察比较培养基中菌落生长情况。放置未接种培养基的目的是_____。
(4)在泡菜发酵过程中会产生亚硝酸盐， 为了把握取食泡菜的最佳时机，在腌制过程中要注意控制腌制时间、温度和_____以降低亚硝酸盐的含量。研究小组定期测定亚硝酸盐含量的方法是_____。

7 . 解磷菌是一种能将土壤中植物不能利用的磷转化为植物可以利用磷的功能微生物(主要为细菌)，在提高土壤中有效磷含量、促进磷循环方面发挥着重要作用。解磷菌能分解含磷化合物使得菌落周围出现透明圈。下图为从某植物根际土壤中筛选出高效解磷菌的部分流程示意图，步骤Ⅰ表示将1 g土壤加入100 mL灭过菌的PVK培养基培养。36 h后，取10 mL培养液接种于100 mL PVK培养基继续富集培养；连续富集培养3次后进行实验步骤ⅡⅣ(B、C中培养基的营养成分与A相同)。请据图回答：

(1)用于培养解磷菌的培养基在接种前需要通过_________法进行灭菌。从成分上看，与A相比，B中多了____________(填物质名称)。
(2)在操作Ⅱ、Ⅲ中，采用的接种方法分别是___________、____________。
(3)为了尽快观察到解磷菌培养的实验结果，应将接种了样品的平板倒置于___________中培养，并同时在另一平板上接种无菌水作为对照进行实验。
(4)在固体培养基中分离培养出解磷菌后，需通过测量___________________直径，比较它们的比值以确定其解磷能力从而筛选出目标菌株。
(5)分离出的解磷菌，需通过分子鉴定以确定种属关系。常用的方法是对细菌的核糖体RNA(16S rRNA)所对应的16S rDNA进行序列分析(基因公司测序)，在测序前一般采用菌落PCR的方法进行扩增。

①在PCR实验的具体操作时，按照事先设计好的配方用_______________向微量离心管中依次加入各组分，按照上图的设计设置好PCR程序，其中a表示________________。
②在进行菌落PCR时，首先根据____________两端的脱氧核苷酸序列来设计引物。已知相关的上游引物序列为5'-GCAATGCGTAGCCTCT—3'，则下游引物的序列最合适的是_______。
a． 5'—ACAATATGTATAATCT—3' b． 5'—TCATGAGCGCATAGTT—3'
c． 5'—GCAATGCGTGCATTGC—3' d． 5'—AGAGGCTACGCATTGC—3'
③PCR 扩增时，除加入16S rDNA作为模板、引物外还需要加入________________等，如果将其复制20次，需要引物________对。

10 . 敌敌畏是一种有机磷农药，使用后残留严重且难以降解，对环境造成危害。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解敌敌畏的细菌（目标菌），具体流程如下图所示：
(1)研究人员应从_____________________中采集土样，取土样用的小铁铲和盛土用的信封在使用前都要_____________________。
(2)称取5g土壤样品，加入到装有45mL无菌生理盐水的锥形瓶中，振荡培养制成菌悬液，吸取1mL菌悬液加入到含有9mL无菌生理盐水的试管中，制成稀释________倍的菌悬液，按此方法依次系列稀释；取0．1mL各浓度梯度的菌悬液分别接种到固体培养基上，该接种方法为________________________。
(3)由流程图可推测“目标菌”的呼吸类型为_______________；培养微生物的锥形瓶及保藏菌种的试管均使用到棉塞，推测棉塞的作用为______________________________。
(4)分离纯化后的微生物最初不一定具有降解敌敌畏的能力，所以要对菌株进行驯化，使其具有较高的速率来降解目标农药敌敌畏，从而筛选出耐药菌株。驯化的实质是在特定条件下，将耐药的微生物定向富集的过程。请你结合题意，简述驯化的实施方案： ____________________________。