3 . α-淀粉酶催化淀粉生成麦芽糖直至葡萄糖的反应，一些具有独特性能（如低温催化）的α-淀粉酶在食品、日用品等多个工业领域中具有重要用途。
(1)为了找到性能优异的α-淀粉酶，科研人员从世界各地的微生物中鉴别出多种不同结构和性能的α-淀粉酶，其活性部位的氨基酸序列比较如表1所示。表中数据可作为生物进化的______证据。

微生物名称	α-淀粉酶活性部位氨基酸序列	性能
黑曲霉	…DVVANH…GEV…NHD…	来自温带土壤，常温催化
假交替单胞菌	…DVVINH…GEA…NHD…	来自北极海底，低温催化
酵母菌	…DGVFGH…GYG…NHD…	来自温带海洋，常温催化
解淀粉芽孢杆菌	…DVVLNH…GIW…HFN…	来自热带土壤，高温催化

(2)为了比较不同来源淀粉酶的活性，科研人员设计了如下所示的实验。试在表格2中的①②③处填写相应的数值。

试剂（mL）	管号	1	2	3	4
蒸馏水		0.4	0.4	0.4	①____
缓冲液		0.5	0.5	0.5	0.5
淀粉溶液		2.0	2.0	2.0	2.0
假交替单胞菌提取液		0.1
酵母菌提取液			0.1
解淀粉芽孢杆菌提取液				②____	③____
总体积		3.0	3.0	3.0	3.0

(3)科研人员挑选表1中假交替单胞菌的α-淀粉酶基因Amy3与质粒pET-22b连接，并转入大肠杆菌中表达。根据图1所示信息，质粒应用限制酶____________切开。

(4)已知大肠杆菌不能分泌表达出的重组α-淀粉酶，因此分离纯化重组α-淀粉酶的第一步操作应是____________。在很多情况下，获得的纯酶还需要固定化，其目的是____________。
(5)欲测定重组α-淀粉酶的活性，检测实验结果可选用的试剂是____________。
(6)科研人员在调查上述重组α-淀粉酶的最适pH时，使用了三种化学成分不同的pH缓冲液（因为每种缓冲液只能维持有限的pH范围），实验结果如图2所示。试解释在pH为7.5和9.0时实验数据不吻合的原因是____________。

4 . 酶工程就是将酶或微生物细胞、动植物细胞、细胞器等在一定的生物反应装置中，利用酶所具有的生物催化功能，借助工程手段将相应的原料转化成有用物质并应用于社会生活的一门科学技术。它包括酶制剂的制备、酶的固定化等方面内容。回答下列问题：
(1)酶制剂常用于洗涤剂中，如加酶洗衣粉，目前应用最广泛、效果最明显的是___________酶，这些酶能否直接加入洗衣粉中，并请说明原因。_____________________________________。
(2)ɑ -淀粉酶在啤酒生产中具有重要作用，能提高啤酒的品质，降低啤酒生产的成本。为获得大量的ɑ-淀粉酶，科研人员从黄曲霉中提取并制备ɑ -淀粉酶，流程如图所示：

①大池培养的目的是_____________；在提取酶液时，使用1% NaCl的作用是_______________；
提取酶液温度要低于霉菌培养的温度，最可能的原因是______________________。获取的酶液还需用乙醇处理，这样做是为了________________________________。
②也可以采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离提取液中的ɑ-淀粉酶，在该方法中加入SDS的目的是______________________________________。
③为使ɑ -淀粉酶在啤酒生产中能重复利用，可采用物理吸附法和化学结合法将ɑ-淀粉酶进行固定，与物理吸附法相比，化学结合法固定酶存在的弊端是___________________________（答一点）。

5 . 回答下列（一）、（二）小题：
（一）研究表明低温发酵可以显著提高果酒的口感，但发酵的速度却过于缓慢。为克服这一缺点，科研人员制备了一种在低温下具有较强发酵能力的固定化酵母菌。请回答以下问题：
(1)为获取具有较强发酵能力的酵母菌，科研人员将普通酵母菌用紫外线照射等方法进行__________处理，选择在低温条件上能大量繁殖的酵母菌分别接种于等量的葡萄糖培养液中，然后置于低温、__________条件下培养。一段时间后，取适量发酵液离心，取__________与相应的显色剂反应后，用光电比色法测定酒精含量，从而选择高活性的菌种制成干酵母。
(2)在超净工作台中，将耐低温的高活性干酵母置于适宜温度的__________溶液中，待酵母悬液中出现气泡后，加入包埋介质制备成固定化酵母菌，最后用无菌水清洗以除去__________。用固定化酵母菌能明显缩短果酒发酵时间的原因是固定化使__________，形成酵母菌密度较高的发酵环境，从而加快反应速度。
(3)果酒在醋杆菌的作用下可转为果醋。将果酒、水、醋杆菌等混合液倒入发酵瓶时，不能让发酵瓶中有游离液体存在的主要目的是__________。为鉴定果醋是否酿制成功，除可以通过观察菌膜、嗅之外，还可以通过检测__________作进一步的鉴定。
（二）下图表示获得抗除草剂转基因玉米的培育过程，图中的报告基因只能在真核生物中正确表达，其产物能使某种能被细胞吸收的无色物质K呈现蓝色。请回答以下问题：

(4)构建重组质粒是基因工程的核心，此过程通常需要__________和DNA连接酶等工具酶。Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，其上有一段包含报告基因的T－DNA序列，因该片段能进入植物细胞并__________，从而使其携带的目的基因的遗传遵循孟德尔定律。
(5)图中筛选1的目的是__________。农杆菌转化愈伤组织的过程中，愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。因此，进行筛选2时，应在培养基中加__________，并挑选__________的愈伤组织细胞，用于植物组织培养。
(6)将单个转化的愈伤组织细胞置于适当的液体培养基中，经过适当配比的__________诱导，可发育成胚状体，最后发育成完整的植株。此过程始终要在适宜温度、适宜培养基及__________等条件下进行。

7 . 回答下列（一）、（二）小题：
（一）回答与α-淀粉酶的制备和固定化过程有关的问题：
（1）为了获得优良的枯草杆菌菌株，研究者取5克土样加到有95ml_________的三角瓶中，振荡10分钟，即成10-1土壤液。为了进一步稀释土壤液，应用_________吸取悬液，制成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5的土壤稀释液。
（2）筛选产α-淀粉酶的枯草杆菌时，用较低浓度的_________作为培养基中的唯一碳源，接种时宜采用_________接种法。
（3）α-淀粉酶宜采用吸附法进行固定化，下列关于反应柱的理解，正确的是_________
A．反应物和酶均可自由通过反应柱
B．反应物和酶均不能通过反应柱
C．反应物能通过反应柱，酶不能通过反应柱
D．反应物不能通过，酶能通过
（4）为了确定筛选出的α-淀粉酶的应用价值，还需要进一步检测固相α-淀粉酶的活性，在该实验中，亲和层析洗脱液中加入KI-I2指示剂后，试管中呈现_________色。相对于唾液淀粉酶，枯草杆菌产生的α-淀粉酶具有_________特性，从而有利于工业生产。
（二）基于哺乳动物细胞表达的基因工程制药行业在最近10年发展迅速，其中构建稳定表达细胞株是最重要的环节，常见过程为：获得目的基因—将目的基因导入宿主细胞—初步筛选—扩增—单克隆化—筛选—驯化-工业生产。回答下列问题：
（1）如果该目的基因的序列是未知的，我们可以建立一个_________，然后在这里面寻找到要研究的目的基因。
（2）为了实现工厂化生产蛋白质类药物，常用CHO细胞（中国仓鼠卵巢的建株纤维母细胞）作为哺乳动物表达系统的宿主细胞，这种细胞应该具有_________能力，从而可以反复传代使用。为了得到CHO细胞,可以直接将组织从机体中取出后立即进行细胞、组织培养，当细胞从组织块中迁移出来，形成_________并增大后，再传代培养。
（3）利用“裹有重组质粒的脂质体与动物细胞融合”、“病毒侵染细胞”是将目的基因导入动物细胞的两种常用方法，前者所用的脂质体结构上由_________分子构成，后者不能用噬菌体的原因是_________。
（4）对细胞进行单克隆化培养时，培养基中往往需要添加血清、激素、滋养细胞等，这些措施的目的是_________。确定生产用的细胞株后，需要对细胞驯化使其适应生产规模下的培养条件，工业生产使用的培养基大多是无血清培养基，这对生物制品的好处有_________

8 . 回答下列（一）、（二）小题：
（一）实验表明，细菌中芽孢杆菌降解率最高，真菌中毛霉降解率最高，且两者混合效率更佳。回答与固定化混合菌对土壤中苯并芘（BaP）降解效果有关的问题：
（1）高效降解菌筛选试验：土壤过2mm筛后，分装培养瓶中，每瓶30g，___℃高压蒸汽灭菌15min，冷却后，在无菌条件下移入一定量的BaP丙酮溶液，放置过夜。再按10%量接种菌悬液，通过灭菌棉塞控制通气量，以不加菌液为对照，随时补加无菌水，使土壤水分为30%，置25℃恒温箱中避光培养，分别在每隔7d取样测定_____。
（2）实验中BaP的降解结果都有一个共同的趋势：前28d降解转化速度快，随后则出现缓慢的反应趋势，有两方面的原因：其一，_____降低导致反应速度减慢；其二，BaP降解过程是逐步进行的，中间产物与原加入的BaP的竞争代谢也有降低反应速度趋势的可能性。
（3）固定化混合菌的制备：将蛭石载体处理后，再接种游离的____，随着混合菌的生长，部分微生物自然固定在载体上，培养结束后用______洗涤固定化混合菌细胞数次，便制得固定化混合菌，以_____为对照，通过两者质量差计算蛭石对微生物的______。
（二）回答与转基因雷公藤培育过程有关的问题：
（1）将含_____酶的混合液在55℃水浴锅中活化，0.22μm微孔滤膜_____灭菌。取雷公藤悬浮细胞，加入酶混合液，黑暗条件下______培养以分离原生质体。
（2）原生质体的活力检测采用台盼蓝染色法（台盼蓝可穿透死细胞的细胞膜，使死细胞中的DNA着色，但无法进入活细胞内），原生质体活力的计算方法为：_____占该视野下原生质体总数的百分比。
（3）由于原生质体来源于黑暗条件下培养的雷公藤悬浮细胞，因此其细胞中不含_____。将原生质体与含_____ 的植物表达载体质粒混合，在黑暗条件下完成转化后，再用激光作扫描光源的显微镜观察，统计发出绿色荧光的原生质体数占观察到的所有原生质体数的百分比，以此确认原生质体的转化效率。
（4）将转化后的原生质体进行培养，重新长出细胞壁，形成胚性细胞。此时，应该_____培养基中甘露醇浓度，以利于胚性细胞继续培养形成细胞团，然后形成再生植株。再生植株需去除_____处理，并进行锻炼后才能移种大田。