1 . CRISPR是原核生物基因组内的一段重复序列，Cas基因编码的Cas蛋白能与CRISPR序列区域共同发生作用。外源DNA入侵细菌后，细菌将外源DNA的部分片段整合到CRISPR中，当相同的外源DNA再次入侵时，细菌利用CRISPR/Cas9系统切割外源DNA，使之失效。CRISPR/Cas9系统广泛应用于基因工程领域，用于修改基因组中的特定序列，机制如图1所示。回答下列问题：

(1)分析图1可知，利用CRISPR/Cas9系统进行基因组编辑时，首先根据靶基因的特定序列合成sgRNA（向导 RNA）。向反应体系中加入sgRNA和Cas9蛋白，sgRNA和Cas9蛋白的作用分别是___、___。
(2)CRISPR/Cas9基因编辑技术存在“脱靶”的风险,原因可能是___。CRISPR/Cas9系统可视为细菌的天然免疫系统，此外，细菌还可以通过___来识别和切割外源DNA，以维持自身遗传特性的稳定。
(3)研究发现恶性肿瘤的发生与TDO2基因有关。科研人员用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除TDO2基因的部分外显子（如图2所示），构建TDO2基因敲除纯合模型小鼠（2n），以研究TDO2基因的调控作用。经过相关的操作获得多只小鼠，并检测小鼠TDO2基因的敲除情况。
①分别提取野生型小鼠和实验小鼠体细胞的DNA作为模板，PCR扩增时应选择图2中的引物对___，鉴定时才能区分各小鼠的基因敲除情况。DNA聚合酶沿着5＇→3＇方向合成子链，引物为子链的延伸提供了___（填“5＇”或“3＇”）端。
②对PCR产物进行鉴定，结果如图3所示。根据电泳图，应选择___（填“1号”或“2号”）小鼠研究TDO2基因的调控作用，原因是___。

3 . 为了深入的研究“亨廷顿舞蹈症”的治疗方法，2018年我国科学家利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将人亨廷顿舞蹈病致病基因（HTT基因）“敲入”猪基因组内，获得了人－猪“镶嵌”HTT基因，该技术主要由Cas9蛋白和向导RNA复合物完成（如图1所示），再利用生物工程技术成功地构建了亨廷顿舞蹈病的动物模型（如图2所示）。

(1)据图1分析，CRISPR-cas9系统的功能与____相似。

A．DNA连接酶	B．DNA解旋酶
C．DNA水解酶	D．限制性内切核酸酶

(2)图1中猪基因组上的PAM序列是一个NGG序列（N可以是任何一种碱基），能被CRISPR-cas9系统识别，并在该序列附近有酶切位点，请分析PAM序列互补链上的碱基序列可以是____。

A．TGG

B．CCC

C．GCC

D．AGG

(3)据图2判断，通过CRISPR/Cas9技术基因编辑后，将含有“敲入”序列的猪胚胎成纤维细胞的细胞核导入去核的卵母细胞，最终由3号母猪产出4号小猪的过程，用到的生物技术是____。

A．胚胎移植技术	B．动物细胞培养技术
C．动物细胞融合技术	D．细胞核移植技术

(4)图2中1-4号猪中可能成为亨廷顿舞蹈病动物模型的是____号。如果经基因编辑后，人－猪“镶嵌”HTT基因只在猪成纤维细胞的一条染色体DNA上，那么想获得纯合能稳定遗传“人－猪“镶嵌”HTT基因”的亨廷顿舞蹈病动物模型猪，你的思路是____。

4 . 下图为“乙肝基因工程疫苗”生产过程的图解，质粒上箭头所指部位为相应的限制酶的切割位点。质粒中lacZ基因编码产生的酶可以分解培养基中的X-gal，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。请回答下列问题：

(1)过程 ①为了防止目的基因和质粒的自身环化，选用限制酶的最佳方案是       。

A．只有BamHⅠ	B．BamHⅠ和EcoRⅠ
C．EcoRⅤ和BamHⅠ	D．EcoRⅤ和EcoRⅠ

(2)限制酶切割后，需要用 DNA 连接酶连接形成重组 DNA 分子，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是___________。
(3)基因工程的四步程序是目的基因的获取、构建基因表达载体、_____________和目的基因的检测与鉴定。其中在构建基因表达载体时，所用载体除了质粒以外，还可以选择__________、________(答出2点)。
(4)过程②处理大肠杆菌后，大肠杆菌处于_______________的生理状态。
(5)为了筛选含目的基因表达载体的大肠杆菌，可在培养大肠杆菌的培养基中额外加入_____，培养 段时间后挑选出__________(填“蓝色”或“白色”)的菌落进一步培养，从而获得大量目的菌。
(6)目的基因导入受体细胞后，常用_________技术检测目的基因是否翻译出乙肝病毒外壳。

5 . 人促红细胞生成素（EPO）是一种可用于治疗肾性贫血的糖蛋白类激素，可用乳腺生物反应器生产 EPO。为了避免外源 EPO 基因随机整合到染色体 DNA 上， 科研人员设计和构建了大鼠染色体定位整合克隆载体，利用大鼠乳清酸蛋白（WAP）基因上游的调控序列及启动子和 3′UTR 序列构建了基因表达载体。构建前，科研人员扩增了 WAP 基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入 EPO 基因中，以确定 WAP 基因启动子的具体位置，相关信息如图所示。

   

(1)在扩增 WAP 基因上游不同长度的片段时，PCR 反应体系中通常都应该含有____酶、dNTP、Mg²⁺、缓冲剂系等。在反应过程中，反应体系中加入 dNTP 的作用是为扩增提供____。
(2)为将扩增后的产物定向插入到基因表达载体中，以指导 EPO 基因的表达，需要在引物末端添加特定的限制酶识别序列。由图中信息可知，在 P1～P4 末端添加的序列所对应的限制酶是____，在 A 末端添加的序列所对应的限制酶是____。
(3)将 PCR 后得到的含不同长度的 WAP 基因上游序列与 EPO 基因连接，构建成基因表达载体，这一过程共需要____种酶参与。检测转基因雌性大鼠时发现，导入含 P1～P3 与A扩增产物的个体乳汁中有 EPO，而含 P4 与 A 扩增产物的个体没有 EPO 生成。含 P4 与A扩增产物的个体没有 EPO 生成的原因是____。
(4)该实验中，在 EPO 基因上游插入大鼠 WAP 基因启动子的理由是____。
(5)科研人员不选用大肠杆菌作为该实验的受体细胞，从基因表达的角度分析，其原因是____。

7 . CRISPR/Cas9是目前应用最广泛的基因组编辑技术，能对DNA分子中的基因进行编辑，引入人们想要的基因或破坏已有的基因。使用该技术，需要向要进行编辑的细胞中加入以下主要组分：人工合成的向导RNA和一种来自细菌的核酸酶Cas9蛋白。其原理是向导RNA与DNA分子中希望被编辑的序列通过碱基互补配对结合后，Cas9蛋白再结合上去对与向导RNA结合的DNA进行切割，使DNA双链断裂，过程如下图所示。回答下列问题：

(1)据图推测，向导RNA的作用是_______；Cas9蛋白的作用是_______。
(2)当DNA双链断裂后，可导入目的基因，目的基因的导入往往需要利用基因工程方法构建基因表达载体，基因表达载体上除了含有目的基因和标记基因，还必须有_______、_______。
(3)目的基因在与运载体结合前需要用PCR技术进行大量扩增，该过程需要_______酶，该酶与普通DNA聚合酶相比，其特点是_______。
(4)与传统的限制酶切割基因技术相比，CRISPR/Cas9基因编辑技术的明显优点是_______。

9 . 为更好的利用农杆菌转化玉米，科学家将基因编辑系统引入农杆菌Ti质粒对其进行改造。
(1)Ti质粒在基因工程中常作为_____。改造后的Ti质粒的部分序列如图1所示，转入玉米细胞后，gRNA能够与玉米细胞DNA特定位点结合，从而引导Cas9蛋白在此位点切断____键断开DNA。HR1和HR2与玉米DNA切断位点上下游序列同源，玉米细胞能以同源序列之间的序列为模板合成一段DNA，连接断开的DNA分子，实现外源片段插入。图1中插入玉米染色体的片段能稳定表达和扩增，其他区域的基因只能瞬时表达且无法扩增。在转化玉米的过程中，使用改造后的Ti质粒的优点是____。

(2)用上述改造后的农杆菌转化玉米幼胚，在培养基中加入除草剂或_____均能筛选出已发生转化的幼胚。对培养后的植株进行PCR（引物设计如图2），部分植株实验结果如图3。


电泳结果显示____号玉米中成功插入了外源基因，自交后____（选填“会”或“不会”）发生性状分离。
(3)标记基因插入转基因作物染色体中往往会影响植物的生长发育，并带来环境安全隐患。现要制备转耐寒CXE-20基因的转基因玉米，请利用该方法设计Ti质粒相关序列，选择相关基因的序号填入Ti质粒部分序列示意图。

①____②____③____④____⑤____⑥____⑦____

10 . 重组PCR技术是一项新的PCR技术，可将原来两个不相关的DNA连接起来，组成一个新的分子。实验小组从猪源大肠杆菌中扩增得到LTB基因和ST1基因片段，用重组PCR技术构建了LTB-STl融合基因。融合基因的制备过程如图所示。回答下列问题：
   
(1)PCR实验中，为防止外源DNA等因素的污染，使用的微量离心管、缓冲液、蒸馏水等在使用前必须进行________。PCR过程中，子链延伸需要在______进行，在________的催化作用下，该酶需要被________（填离子）激活后才能发挥作用。
(2)设计引物时，引物P1与引物P2的碱基序列________（填“能”或“不能”）互补；引物P2与引物P3的碱基序列________（填“能”或“不能”）部分互补，原因是________。
(3)DNA子链是从5′端向3′端延伸。为了使杂交链顺利延伸子链，至少需要经过2次循环才能得到用于杂交的目的链L、S，则第2次循环的目的是________________。
(4)杂交链延伸生成LTB-ST1融合基因的过程中，________（填“需要”或“不需要”）加入引物。在图中标出杂交链两条母链的3′端和5′端，________