1 . 干扰素是动物体内合成的一种糖蛋白，体外很难保存。如将干扰素分子的一个半胱氨酸改造成丝氨酸，体外-70℃下可以保存半年。下图是利用蛋白质工程设计生产干扰素的流程图，有关叙述错误的是（       ）

   

A．干扰素是具有干扰病毒复制的作用的糖蛋白，被广泛应用于治疗病毒感染性疾病

B．蛋白质工程是改造现有蛋白质或制造新的蛋白质，以满足人类的需求

C．将新的干扰素基因插入启动子和终止子之间是其成功表达的条件之一

D．新的干扰素基因在大肠杆菌体内正常表达即可得到预期的新的干扰素

2 . 胃幽门螺杆菌（Hp）与胃炎、消化性溃疡和胃癌等多种疾病有关。Hp的Ipp20基因能指导合成其特有的Ipp20蛋白，科研人员培育出转Ipp20基因山羊（将Ipp20基因导入山羊受精卵）利用乳腺生物反应器制备Hp疫苗。所用质粒和Ipp20基因两端序列以及相关限制酶识别序列如图所示，已知Ipp20基因内部不含MfeI酶切序列而外部两端含有，回答下列问题：

限制酶	EcoRI	BamHI	HindⅢ	MfeI
识别序列和切割位点（5′-3′）	G↓AATTC	G↓GATCC	A↓AGCTT	C↓AATTG

(1)获取Ipp20基因的常用方法是PCR技术，PCR反应缓冲溶液中添加的作用是______。
(2)构建基因表达载体时，如果选择MfeI一种酶对目的基因和质粒进行切割，缺点是______，如果选择EcoRI和HindIII，利用PCR扩增Ipp20基因时，需要在两种引物上分别添加两种限制酶的识别序列，从而扩增出两端带有两种限制酶识别序列的Ipp20基因。依据图中已知碱基序列，在PCR扩增仪中加入的引物的碱基序列为5′______3′，和5′______3′。
(3)转Ipp20基因山羊利用乳腺生物反应器制备Hp疫苗，构建基因表达载体时需要选择______基因的启动子，通过______的方法导入山羊的受精卵中。
(4)重组质粒导入山羊受精卵内，对受精卵______（填“有”或“无”）性别要求？理由是______。

3 . HNP1是人的一种抗菌肽蛋白，具有增强机体免疫力功能。某畜牧研究所利用CRISPR/Cas9技术生产乳腺特异性分泌HNP1的基因编辑山羊。根据特异性表达于山羊乳腺的β－酪蛋白（β－CN）第一外显子序列设计和构建特异性sgRNA，Cas9蛋白在sgRNA引导下切割β－CN的双链，使其断裂，促使细胞启动自然的DNA修复过程，以包含HNP1基因的同源重组载体为模板DNA，将HNP1基因精准编辑到山羊基因组，通过山羊乳腺生产抗菌肽蛋白。回答下列问题：
(1)CRISPR/Cas9是应用最广泛的基因组编辑技术。Cas9蛋白与sgRNA形成的复合物与基因工程操作工具中______的功能类似，该工具通过______发挥作用。
(2)将制备的特异性sgRNA，Cas9mRNA以及包含HNP1基因的同源重组载体通过______的方法导入山羊的受精卵，由受精卵发育成的转基因山羊可通过分泌乳汁来生产HNP1，该山羊称为______。该种方法可让山羊批量生产HNP1，但也有不足之处，如______（答出1点即可）。
(3)根据特异性表达于山羊乳腺的β－酪蛋白（β－CN）第一外显子序列设计和构建特异性sgRNA的目的是______。
(4)若要验证基因编辑山羊中含有HNP1基因，简要的实验思路是______。

4 . 半乳糖醇可作为新型甜味剂应用于糖果、面包等食品工业。酿酒酵母长期用于食品加工业，具有很强的食品安全性与大规模发酵能力。为构建酿酒酵母工程菌株生产半乳糖醇，回答下列问题：
(1)为将木糖还原酶基因（如图甲）准确连接至pRS313质粒（如图乙）内，需在引物1、2的5’端分别引入限制酶B、A的识别位点，经PCR扩增得到木糖还原酶基因。对目的基因和pRS313质粒进行限制酶B、A双酶切处理，目的是____。经酶切后的目的基因和质粒经DNA连接酶连接得到____。

（注：氨苄青霉素作用于细菌的细胞壁，抑制细菌细胞壁的合成）
(2)将重组质粒导入____（填“酿酒酵母”或“大肠杆菌”）中，采用____法将菌液接种至含有氨苄青霉素的LB平板进行筛选。挑取单菌落进行DNA测序，测序验证正确后，利用质粒提取试剂盒提取重组质粒。
(3)将重组质粒导入酿酒酵母时，需利用醋酸锂-Tris-EDTA．缓冲液-PEG共同处理酿酒酵母，其中EDTA的作用是抑制DNA酶的活性，防止____。
(4)取各重组菌株制成等浓度的菌液，等量接种到含等量D-半乳糖的培养基中，发酵12h后立即离心并分离沉淀和上清液以终止发酵。测定上清液中半乳糖醇的含量，比较各重组菌株单位时间内半乳糖醇的产量，结果表明导入黑曲霉木糖还原酶基因anxr的pRS313-anxr工程菌株是优势菌株。这属于对____（填“基因”、“基因表达产物”或“个体性状”）的检测，检测时需以____菌株作为阴性对照。
(5)pRS313-anxr工程菌株中D-半乳糖的代谢途径如图丙，为进一步提高D-半乳糖转化为半乳糖醇的效率；研究者对工程菌中的半乳糖激酶基因进行____，通过DNA测序筛选成功改造的菌株。据图分析，除木糖还原酶和半乳糖激酶外，限制半乳糖醇产量的因素还有____（写出2点即可）。

6 . 防御素是一类富含二硫键的阳离子型多肽，广泛分布于真菌、植物与动物中，是生物免疫系统中的重要调节分子。β-防御素是一种由H基因编码的抗菌肽，抑菌谱广。长春生物科技研究所通过构建重组酵母菌进行发酵，获得了β-防御素。回答下列问题：
(1)为获得β-防御素基因，研究者利用致病细菌的脂多糖（LPS）刺激结肠癌细胞株提高β-防御素的表达量，提取总RNA，经过______后，作为模板进行PCR扩增。PCR产物常采用_______来鉴定，鉴定后进行测序。测序结果与_______数据库中的公开数据进行比较，进而得到正确的β-防御素基因。
(2)本实验选用毕赤酵母表达载体pPIC9K（如图），扩增目的基因时设计的1对引物为P1（5'ATCGAATTCATGGGAAGTCATAAACACATTAGA3'）和P2（5'TATAGCGGCCGCCTATTTCTTTCTTCGGCAGCAT3'）。

①本实验中引物的作用是______（答出2点即可）；
②部分限制酶识别序列及切点如下表，结合图中限制酶切点与引物，推测本实验酶切时，选用的两种限制酶是_______，采用双酶切法的优势是_____（答出2点即可）。

限制酶	识别序列及酶切位点
BglIl	5'..A↓GATCT…3'
EcoR I	5'…G↓AATTC…3'
SnaB 1	5'TAC↓GTA.3'
Sac	5'..-GAGAC↓C--.3'
Avr lI	5'..C↓CTC…3'
SulI	G↓TCCGAC…
Not I	5.. CC↓GGGCCGC…3

(3)毕赤酵母表达系统最大的优点是可对β-防御素_____（答出2点即可），直接表达出具有生物活性的产品。
(4)毕赤酵母表达系统发酵结束后，采取适当的_____措施来获得产品。

9 . 透明质酸是一种应用广泛的粘性多糖，研究者欲改造枯草芽孢杆菌，通过添加诱导型启动子来协调菌体生长与产物生产之间的关系。
(1)图1中透明质酸合成酶基因H以a链为转录模板链，由此可以推测H基因的转录是从其______________（填“左侧”或“右侧”）开始的。透明质酸合成酶基因H上的一段核苷酸序列为“-ATCTCGAGCGGG-”，则对该序列进行剪切的Xho识别的核苷酸序列（6个核苷酸）最可能为______________。
(2)为通过外源添加诱导剂来控制基因的表达，研究者选择了含木糖诱导型启动子的p质粒。为保证图1中酶切后的H基因按照正确的方向与p质粒连接，p质粒位点1和2的识别序列所对应的酶分别是________________，酶切后加入_______________酶使它们形成重组质粒。

(3)为协调菌体生长与产物生产之间的关系，将构建好的重组质粒转入经______________处理后的枯草芽孢杆菌（D菌），在含________________的培养基上筛选，得到枯草芽孢杆菌E（E菌）。对E菌进行工业培养时，培养基应先以蔗糖为唯一碳源，接种2小时后添加_____________，以诱导E菌产生更多的透明质酸。
(4)质粒在细菌细胞中遗传不稳定、易丢失，研究者尝试将重组质粒进行改造，利用同源区段互换的方法将H基因插入枯草芽孢杆菌D的基因组mpr位点，得到整合型枯草芽孢杆菌F（F菌）。请在图2方框中画出F菌的基因组______________。

(5)对三种枯草芽孢杆菌进行培养，结果如图3，_______________最适宜工业发酵生产透明质酸，请阐明理由______________。