25. 研究发现,大部分白血病患者细胞中存在异常的融合基因UBA2—WTIP,可作为检测白血病的特异性分子标志物。科研人员通过RT—PCR方法克隆得到融合基因UBA2—WTIP,为了研究该基因的作用和致病机制,需要构建重组载体并把目的基因和FLAG标签基因序列连接起来,分别获得带有FLAG肽链的UBA2—WTIP融合蛋白和WTIP蛋白。FLAG肽链由8个氨基酸残基组成,可作为基因工程中蛋白质是否表达的标记。
(1)科研人员以提取的某白血病人外周血细胞总RNA为模板,经过
_____过程合成cDNA,设计
_____种引物,经RT—PCR扩增出融合基因UBA2—WTIP。对测序结果进行数据分析,推测融合基因UBA2—WTIP是在UBA2基因的第16外显子与WTIP基因的第2外显子处拼接而成,如图1所示。为了验证该融合基因的产生是基因组DNA融合而不是不同的RNA剪接后逆转录所产生的,可通过PCR验证,其实验思路和预期结果为
_____。
(2)为了构建重组载体,科研人员设计了以下2种引物,如图2所示:
上游引物F
2为:5’TATGGTACCATG①GCACTGTCGCGGGGG3’,GGTACC为Kpn Ⅰ酶切位点;
下游引物R
2为:5’TAT②TCA③GAGCTCAGTGACGTG3’;
FLAG标签基因编码链序列(5’GATTACAAGGATGACGACGATAAG3’)可以插入目的基因编码区的首端或者末端。已知引物中ATG对应起始密码,若UBA2—WTIP融合基因编码的蛋白质前端有一段信号肽,则FLAG标签基因序列一般不能插入①位置,原因是
_____;若在下游引物R
2②③处插入FLAG标签基因序列和EcoR Ⅰ酶切位点,已知引物中TCA对应终止密码,位置③处序列为5’
_____3’。
(3)制备的重组载体体外转染人类白血病细胞株KG—la细胞,提取各细胞总蛋白,用FLAG单克隆抗体检测蛋白表达情况,并分别测定转染空质粒的对照细胞、转录UBA2—WTIP融合基因及转录WTIP基因的KG-la细胞增殖情况,结果分别如图3所示。
检测相关蛋白质是否表达的方法是
_____;上述生长曲线结果说明
_____。