【推荐1】L-天冬酰胺酶因其能水解L-天冬酰胺（丙烯酰胺的前体），而有效降低油炸食品中潜在致癌物质丙烯酰胺的含量，在食品安全领域受到高度关注。某科研机构欲利用pET22b质粒将L-天冬酰胺酶基因导入对氨苄青霉素敏感的宿主菌中，以构建高效表达L-天冬酰胺酶的菌株。图1是L-天冬酰胺酶基因附近的限制酶切点以及基因两侧的部分碱基序列，图2是pET22b质粒的结构模式图及其涉及的限制酶切点，其中的LacZ基因编码产生的半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈蓝色，否则菌落为白色。   

(1)利用PCR从提取的DNA中扩增目的基因时需要引物，引物的作用是____________。要将L-天冬酰胺酶基因导入到pET22b质粒中，需使用的两种限制酶是____________。
(2)若图1下方的序列为目的基因的部分碱基序列，则获取目的基因时设计B端的引物序列是____________（只写出16个碱基即可）。
(3)利用感受态法的转化成功率并不是100%，科研人员将转化后的宿主菌接种在含氨苄青霉素和X-gal的固体培养基上，以此筛选出成功导入重组质粒的宿主菌。
①若只使用限制酶EcoRI构建重组质粒，导入重组质粒的菌落呈现___________色，这些菌落___________（填“能”、“不能”或“不一定能”）产生L-天冬酰胺酶，理由是___________。
②若使用（1）中的限制酶处理，则菌落呈____________色的为符合要求的宿主菌，理由是___________。
(4)能够发挥作用的L-天冬酰胺酶是由4个亚基形成的，如果选择大肠杆菌作为受体菌，只能从大肠杆菌中提取到4条单链肽链，不能得到有活性的L-天冬酰胺酶，原因是___________。

【推荐2】北极比目鱼中有抗冻基因，其编码的抗冻蛋白具有11个氨基酸的重复序列，该序列重复次数越多，抗冻能力越强。下图表示将抗冻基因导入番茄细胞中以获取转基因抗冻番茄植株的过程。回答下列问题：

(1)利用PCR技术将北极比目鱼细胞中获取的抗冻基因进行大量扩增，PCR技术的原理是__________，扩增抗冻基因时需要设计引物，合成引物的前提条件是__________。
(2)农杆菌的Ti质粒上具有一段T-DNA，该DNA的特点是__________。通过基因工程技术获取抗冻番茄植株，该技术的核心步骤是__________。
(3)将导入了表达载体的农杆菌与取自番茄的细胞共同培养，通过农杆菌的__________，就可使目的基因进入番茄的叶肉细胞，再通过__________技术将细胞培养成完整的植株，与常规的种子繁殖方法相比，利用该技术培育抗冻番茄植株的特点是__________。

【推荐3】植物细胞壁中含大量不能被猪消化的多聚糖类物质，如半纤维素多聚糖、果胶质（富含半乳糖醛酸的多聚糖）等。研究人员通过现代生物技术培育出转多聚糖酶基因（manA）猪，主要流程如图所示，图中neo为标记基因，回答下列问题：
      
(1)图中获取目的基因采用的限制酶是BamHI和BglⅡ，但是处理后的目的基因后并不能避免自身环化，原因是________。处理质粒应采用的限制酶是________。
(2)图中通过PCR技术扩增目的基因的前提是_________，以用于制备PCR扩增需要的引物，引物的作用是________。基因工程的核心环节是图中的________（填标号）。
(3)如果要一次性获得更多的转基因猪，可在囊胚期对早期胚胎进行胚胎分割，操作时要注意_________。获得的转基因猪中的manA主要在_________中进行表达。

【推荐1】某实验小组利用转基因技术培育耐盐水稻，图A表示含有耐盐基因的外源DNA分子，图B表示质粒，其上含有BamHI、SmaI和HindⅢ三种限制酶的酶切位点。请回答下列问题：

(1)分析上图可知，欲构建重组DNA分子，应选用________________两种限制酶切割质粒和外源DNA分子，使用两种不同的限制酶切割目的基因的优点是________________________。
(2)题（1）中不使用另外一种限制酶切割的原因是______________________，题（1）中构建成功的重组质粒若用该酶切割能产生____________种不同的DNA片段。
(3)质粒中的抗性基因的作用是____________。成功导入了目的基因的受体细胞（受体细胞本身不含四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因），不能在含____________（填“氨苄青霉素”或“四环素”）的培养基中进行培养。

【推荐2】马铃薯是重要的块茎类粮食作物。二倍体马铃薯普遍存在自交不亲和的现象，导致无法使用种子种植马铃薯。二倍体马铃薯的自交不亲和是由核糖核酸酶基因（S-RNase）控制的，我国科研人员通过基因编辑技术敲除了马铃薯的S-RNase基因，获得自交亲和的二倍体马铃薯，为马铃薯杂交育种提供了全新的技术体系。下图是科研人员用CRISPR/Cas9基因编辑技术定点敲除S-RNase基因的示意图，回答下列问题：

(1)用于编辑不同基因的CRISPR/Cas9复合物中向导RNA碱基序列不同，因此首先要确定S-RNase基因中的待编辑序列，可以通过PCR技术扩增S-RNase基因，作为编码特定向导RNA的模板。扩增时需要根据__________设计引物，引物的作用是__________。
(2)CRISPR/Cas9系统能精准识别相关基因，依据的原理是向导RNA与目标DNA发生__________；Cas9蛋白可催化__________（填化学键名称）水解，剪切特定DNA片段。
(3)欲检测经上述基因编辑技术得到的植株是否已具有自交亲和性状，最简便的方法是__________。

【推荐1】马铃薯是重要的经济作物，在基因育种方面取得丰硕成果。
(1)马铃薯是双子叶植物，常用__________________法将目的基因导入马铃薯的体细胞中。构建好的基因表达载体基本结构有目的基因、____________、___________、___________、____________五部分。
(2)科学家将目的基因与质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是_______。
(3)可以通过蛋白质工程对马铃薯细胞的相关蛋白质进行改造，其基本途径是从预期____________出发，通过设计蛋白质的结构和推测____________序列，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物功能进行鉴定。
(4)蛋白质工程在本质上属于 _________________。

【推荐2】长期高血糖可引发血管细胞衰老。科研人员为研究S蛋白在因高血糖引发的血管细胞衰老中的作用，以腺病毒为载体将编码S蛋白的S基因导入血管细胞，实现S蛋白在血管细胞中的大量表达。


(1)腺病毒的遗传物质为DNA，其复制需要E₁、E₂、E₃基因共同完成。为将S基因导入腺病毒，科研人员首先构建了含S基因的重组质粒，如图1所示。在构建含S基因的重组质粒时，通过_______的方法可鉴定重组质粒是否插入了S基因。将图1中含S基因的重组质粒用_______酶切割后，获得改造后的腺病毒DNA；将其导入A细胞(A细胞含有E₃基因，可表达E₃蛋白)，如图2所示。腺病毒DNA在A细胞内能够_______，从而产生大量重组腺病毒，腺病毒进入宿主细胞后不整合到宿主细胞染色体上。
(2)综合上述信息，从生物安全性角度分析重组腺病毒载体的优点：_______(写出2点)。
(3)用含S基因的重组腺病毒分别感染正常人及糖尿病患者的血管细胞，使S蛋白在血管细胞中大量表达。对正常人、糖尿病患者及二者转入S基因后血管细胞中能促进细胞衰老的Ⅰ蛋白进行检测，结果如图3所示(颜色越深代表表达量越高)。可用_______法检测Ⅰ蛋白的表达量，实验结果显示_______血管细胞中Ⅰ蛋白表达量最高，推测S蛋白对高血糖引发的血管细胞衰老的作用及机制是_______。

【推荐1】蒂蛀虫是荔枝的重要害虫。科研人员培育转基因抗虫荔枝的过程如下图1所示。图2是SalI、HindⅢ和BamHI三种限制酶的识别序列和切割位点。请回答下列问题：

(1)受体农杆菌细胞在导入重组Ti质粒前，需要先用Ca²⁺处理，其目的是____。外植体（幼嫩的茎段）经过____形成愈伤组织。在愈伤组织形成的过程中，导致外植体被污染的原因可能是____（答出一点即可）。
(2)研究人员采用了如下图3巢式PCR技术获取抗虫基因，巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应（PCR），使用两对PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物（也称外引物）扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部，也称内引物）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。

图3

①PCR产物常采用____来鉴定。
②相比于常规PCR，巢式PCR获得错误目标产物概率____，这是因为____。
③为了使抗虫基因定向插入质粒中，第二次PCR扩增时需要在两个引物5'端分别添加的序列是____。
(3)科研人员采用农杆菌转化法将抗虫基因导入荔枝细胞，由于农杆菌中的Ti质粒含有一段____，能携带目的基因进入受体细胞，并将目的基因整合到受体细胞染色体DNA上。
(4)培育出的荔枝是否具有抗虫性状；可采用鉴定方法是____。

【推荐2】我国是世界最大的棉花消费国、第二大棉花生产国。利用基因工程技术获得的转基因抗虫棉投入种植生产已经非常成熟，尤其是我国独创的花粉管通道法更是一种十分简便经济的方法，为推动基因工程技术的发展也做出了贡献。
（1）花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后滴加_____（填“目的基因”或“含目的基因的表达载体”），使目的基因借助花粉管通道进入_____。
（2）目的基因导入后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过_____才能知道。为确定转基因棉花的DNA上是否插入了目的基因和转基因棉花的目的基因是否成功转录，都会用到分子杂交技术，但两者从杂交对象上的区别是_____。
（3）为检验棉花植株是否被赋予抗虫特性，可以在个体水平上做_____实验。如果抗虫基因导入成功，且与某一条染色体的DNA整合起来，该转基因抗虫棉可视为杂合子，将该转基因抗虫棉自交一代，预计后代中抗虫植株的比例占_____。
（4）基因工程在原则上只能生产自然界_____（选填“已存在”或“不存在”）的蛋白质，这些蛋白质不一定完全符合人类生产和生活的需求。因此，在基因工程基础上产生了蛋白质工程，通过_____，对现有蛋白质进行改造，或制造新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。

【推荐3】下表列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：

(1)一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后，分别含有____个游离的磷酸基团。
(2)若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越____。
(3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是______________________________________
(4)与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ2种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止___________________________________。
(5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入____酶。