1 . 哺乳动物体内一定含量的w—3多不饱和脂肪酸（LCPUFA）可以起到预防心血管疾病的作用，但LCPUFA在大多数动物体内不能合成，只能从食物中摄取。科研人员从秀丽隐杆线虫中获得LCPUFA合成酶基因fat-1（1229bp），培育转fat—1基因家兔，其部分流程如图一所示。

(1)质粒上复制原点序列为复制的起始区域，该区域的序列容易解旋成单链，据此推测该区域中___碱基所占的比例较高，启动子的作用是___。
(2)在构建PEBf质粒时，为确保fat—1基因按正确方向插入，需要双酶切，还需对fat—1基因的引物进行相应设计。已知fat—1基因转录的模板链为a链，与b链结合的引物5’端添加了限制酶识别序列GAATTC，则另一引物5’端需添加的限制酶识别序列为___，理由是___。
(3)转染是将外源分子如DNA、RNA等导入真核细胞的技术。为了检验图一家兔成纤维细胞是否转染成功，科研人员分别提取培养液中各细胞的DNA，利用fat—1基因引物进行PCR扩增后电泳，部分结果如图二所示。据图分析，1组和2组分别是___细胞组PCR产物。
(4)检测转基因家兔细胞中是否含有LCPUFA合成酶，可采用___技术。如果fat—1基因已正确插入PEB质粒且成功转染，但在转基因家兔细胞中没有检测到LCPUFA合成酶，从基因表达载体结构的角度分析，可能的原因是___。

2 . 镰状细胞贫血是一种单基因遗传病，由正常血红蛋白基因（HbA）突变为异常血红蛋白基因（Hbs）引起，它们的某片段如图甲。现对一胎儿进行基因检测，主要原理：限制酶MstⅡ处理扩增后的DNA，加热使酶切片段解旋后用荧光标记的CTGACTCCT序列与其杂交，最后电泳分离。图乙为电泳后荧光出现的三种可能性。下列叙述不正确的是（       ）

A．利用PCR扩增DNA时反应体系中应加入4种dNTP、TaqDNA聚合酶和含Mg2+的缓冲液

B．若该胎儿检测结果为图乙—b，则其为镰状细胞贫血患者

C．荧光标记序列越长，图乙—c中两个DNA条带间的距离越大

D．用限制酶MstⅡ处理DNA不充分，可能把正常人误判为携带者

3 . 图甲是人类某遗传病的家族系谱图，致病基因用A或a表示。分别提取家系中Ⅰ₁、Ⅰ₂和Ⅱ₁的DNA，经过酶切、电泳等步骤，结果如图乙所示。以下说法正确的是（       ）

A．该病属于常染色体隐性遗传病

B．Ⅱ2的基因型是XAXa或XAXA

C．该病在人群中的发病率女性高于男性

D．如果Ⅱ2与一个正常男性随机婚配，生一个患病男孩的概率为1/4

4 . 人血清白蛋白（HSA）是由肝脏细胞合成的，具有重要的医用价值，原本只能从血清中提取，现利用基因工程的方法生产HSA。请结合相关知识回答下列问题。

（图甲为获取的含HSA基因的DNA片段及酶切位点：图乙是三种限制酶的识别序列；图丙为质粒结构示意图）。
(1)科研人员利用人肝细胞中的___构建出cDNA文库，通过该方法合成的DNA含量较少，可通过PCR进行扩增获取较多的DNA分子，根据该基因的序列（5'—CTAGGTCGAAATTC⋯TCTCCAACGATCGG-3'），应选择___作为PCR的引物。
A.引物Ⅰ是5'-CTAGGTCGAAHTTC-3'引物Ⅱ是5'-CCGATCGITGGAGA-3'
B.引物Ⅰ是：5'-CTAGGTCGAAHTTC-3'引物Ⅱ是5'-CTCAACGATCGG-3'
C.引物Ⅰ是5'-GATCAGCTTTTAAG-3'引物Ⅱ是5'-AGAGGTTGCTAGCC-3'
D.引物Ⅰ是5'-GATCAGCTTTTAAG-3'引物Ⅱ是5'-CCGATCGTTGGAGA-3'
为使HSA基因能与质粒正确连接，根据图甲、乙、丙，应选择限制酶___切割目的基因。
(2)PCR扩增结束后需要对PCR产物进行检测，常采用电泳的方法。电泳一段时间后进行检测，若电泳带有___条，且与DNA Marker对比，产物大小正确，表明PCR扩增成功。
(3)目的基因与质粒连接后可以导入到不同的受体细胞中进行表达。若导入到原核生物大肠杆菌中，可用CaCl₂处理大肠杆菌，有利于重组质粒的导入。但由于原核细胞中缺少___等细胞器，不能对表达产物进行加工，可能会影响蛋白质的功能。若将重组质粒导入到真核细胞，如小鼠细胞中，则可避免上述问题的产生。现利用小鼠乳腺作为生物反应器生产该蛋白，可将重组质粒通过___法导入小鼠的___细胞中，然后将转化的细胞进行培养，由于无法进行全体外胚胎培养，___成为胚胎工程中获得转基因小鼠的唯一方法。利用___技术检测小鼠乳腺分泌物，可以判断目的基因是否表达。

5 . Ⅰ.赖氨酸是人体细胞不能合成的必需氨基酸。科学家把某种必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因（R）导入玉米中，使玉米中赖氨酸的含量提高30%。回答下列问题。

(1)随着测序技术的发展，通过化学合成法得到R基因。利用PCR技术扩增R基因时，需要在一定的缓冲液中才能进行，其中需要加入___酶。为了特异性扩增R基因序列，需根据___设计特异性引物。
(2)在构建基因表达载体时，其中载体上启动子的作用___，若为了避免R基因和质粒的自连或反向连接，提高重组效率，应该选择的限制酶是___。
(3)随着转化方法的突破，农杆菌侵染玉米这种单子叶植物也取得了成功。科研人员从新鲜的玉米叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，当农杆菌侵染玉米细胞后，能将Ti质粒上的___转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
(4)检测R基因是否表达的方法是___。在基因工程中若要培养转基因小鼠，将基因表达载体导入受体细胞常用的方法是___。
Ⅱ.乳腺生物反应器是将外源基因定位表达于哺乳动物的乳腺中，通过转基因动物分泌的乳汁来生产重组蛋白，例如，生产可用于治疗血液病、创伤性出血等疾病的重组人凝血因子VⅡ（rhFVⅡ）。请回答下列问题：
(5)为获得人凝血因子，首先要从细胞中获取总RNA，通过___获得cDNA，再进行PCR获得人凝血因子基因。基因表达载体除了包括目的基因外还包括___（至少答出2点）。
(6)人凝血因子cDNA中不含限制酶识别序列，无法直接构建基因表达载体，因此，在PCR时需要在引物上加入限制酶的识别序列，应加在引物的___（填“3’”或“5’”）端才能不影响PCR的顺利进行。
(7)膀胱生物反应器与乳腺生物反应器的优点相同：收集产物蛋白比较容易，不会对动物造成损伤。此外，膀胱生物反应器还具有的显著优势在于不受转基因动物的___（答出1点即可）限制，而且从尿液中提取蛋白质比从乳汁中提取更简便、高效。

6 . 随着全球气候变暖趋势加剧，高温胁迫成为制约世界粮食生产安全的最主要因素之一。据报道，平均气温每升高1℃，会造成水稻减产3%左右。我国科学家研究发现，非洲栽培稻（CG14）的TT3基因具有较强的高温抗性。科研人员提取了非洲栽培稻TT3基因的成熟mRNA，通过基因重组技术，以Ti质粒为表达载体，导入水稻叶片细胞中，使水稻获得对高温的较强抗性。回答下列问题：

   

(1)与非洲栽培稻（CG14）的TT3基因序列相比，图中的TT3基因的cDNA序列所含碱基对数目__________（填“较多”“较少”或“相等”）。采用PCR技术扩增TT3基因的cDNA序列时，需要设计引物，引物的作用是__________。为了使TT3基因的cDNA序列能够被限制酶切割，并与载体准确连接，所选用的限制酶是__________。
(2)PCR完成后常采用__________来鉴定产物。对于PCR扩增后符合要求的产物，通常还需要进行基因测序，原因是__________。
(3)利用农杆菌转化法将构建的Ti重组质粒转入水稻愈伤组织细胞后进行植物组织培养，培养基中需加入__________进行筛选，最终获得四个水稻株系b1、b2、，b3、b4，对这四个水稻株系的TT3蛋白表达量进行测定，结果如图2所示。图2结果__________（填“能”或“不能”）说明b4株系未导人TT3基因，原因是__________。

   

(4)鉴定转基因水稻是否表现出了更强的抗性，需要进行个体水平的检测，检测的思路是__________。

7 . PCR 技术不仅可用于基础研究，还适用于日常的临床诊断、法医学调查和农业生物技术研究。采用PCR方法进行研究，其反应程序如图所示。下列叙述不正确的是（       ）

   

A．PCR 反应中的每次循环的变性、复性、延伸过程，都涉及氢键的形成或断裂

B．延伸和后延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸

C．PCR应用于临床病原菌检测，所用的引物应该能与病原菌的两条单链DNA特异性结合

D．后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分

8 . 下图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列叙述错误的是（　　）

A．用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸，在设计引物时，应尽量避免引物自身或引物之间发生碱互补配对，影响扩增的效果

B．从理论上推测，第n轮循环后同时含有引物A、B的DNA分子占的比例为（2n-1）/2n

C．在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段

D．PCR的产物一般可以利用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定，DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度都会影响DNA在凝胶中的迁移速率

9 . 东北酸菜是白菜经腌制而成的传统食品。发酵过程中常因霉菌等大量繁殖导致酸菜腐败发臭。黑龙江大学科研人员从酸菜中分离出具有高效抗菌活性的乳酸菌用于发酵，将白菜腌制成了口感好、保质期长的“黑大酸菜”。回答下列问题：
(1)为获得具有高效抗菌活性的乳酸菌菌种，需要从市售保质期_________（填“较长”或“较短”）的酸菜中进行筛选。
(2)通常可利用__________法对培养基进行灭菌。筛选乳酸菌所用的固体培养基中因含有碳酸钙而不透明，乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙产生溶钙圈。接种培养后，选择有溶钙圈的菌落，挑取菌种通过液体培养基进行扩大培养后，再采用__________法获得由单个乳酸菌繁殖形成的单菌落并统计数量。
(3)筛选出的乳酸菌能分泌一种新型的细菌素（多肽），因而具高效抑菌活性。研究人员从该种乳酸菌中提取细菌素基因，利用基因工程技术获得了高效表达细菌素的工程菌。
①下面是细菌素基因及其基因表达载体的示意图。利用PCR技术扩增细菌素基因时，应选择的一对引物是__________。PCR过程中，每次循环需经过__________、_________和延伸等三步。若以细菌素基因的甲链为转录的模板链，为构建基因表达载体，应在与甲链结合的引物5′端添加________（填“BamHI”或“NdeI”）的识别序列。

②转化后提取受体细胞中的DNA，并利用①中所选引物进行扩增，并以无菌水做对照，再对扩增产物进行电泳检测，结果如下图：

设置4号的目的是____________（答出一点即可），电泳结果表明_________。
③进一步通过检测与鉴定最终获得了高效表达细菌素的工程菌。

10 . 干扰素是一种广谱抗病毒制剂；是具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），下图为通过基因工程生产干扰素的部分操作，图中①②③④表示相关操作过程。下列相关分析错误的是（       ）

   

A．过程①可以用限制酶或者PCR技术获取干扰素基因

B．过程②需用耐高温的DNA聚合酶和引物

C．过程③操作要注意干扰素基因应包含启动子、终止子及标记基因等结构

D．过程④为目的基因的导入，最后必须对干扰素进行功能活性鉴定