1 . 基因工程技术在动物科学领域有广泛应用，其中嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）技术是一种新兴的免疫疗法，用于治疗某些癌症。简要流程是：先从患者体内分离出T细胞，利用基因工程技术将能识别肿瘤抗原的抗体基因与T细胞的受体基因拼接，再将拼接的基因导入T细胞，体外扩增后回输到患者体内。请回答下列问题：
(1)基因工程的核心步骤是______，该过程需要的工具酶是______。
(2)在目的基因的首端和尾端需分别加上启动子和终止子，启动子是______识别和结合部位，终止子则起到______的作用。为保证目的基因被顺利切割，限制酶切割位点应加在PCR引物的______（填“3”或“5”）端。
(3)简述CAR-T细胞免疫疗法相比传统化疗在治疗癌症时的优势：__________________。（至少答出两点）

2 . 人血清白蛋白（HSA）在临床治疗中具有广泛的应用。某生物制药公司为制备大量的HSA，通过基因工程技术获取重组HSA的两条途径如图I所示。图Ⅱ中，甲为获取的含有目的基因（HSA基因）的DNA片段，EcoRI、BamHI、Sau3AI为三种限制酶，图中箭头所指为三种限制酶的切割位点；乙是三种限制酶的识别序列与切割位点示意图；丙是Ti质粒结构示意图。回答下列问题：

(1)图I中利用大肠杆菌生产HAS的优点是_____（结合微生物的代谢特点分析），但由于细胞中缺乏_____等细胞器，不能对HAS进行进一步加工。
(2)不能使用Sau3AI处理目的基因的原因是_____。根据图Ⅱ可推测用_____处理目的基因，用_____处理质粒最佳，这样可以避免目的基因和质粒自身环化（连接）。
(3)目的基因应插入到Ti质粒的_____，原因是_____。图I中将目的基因导入大肠杆菌时，需要用_____处理细菌，目的是______。

4 . 磷酸吡哆醛(PLP)是维生素B6的活性形式，是多种酶的重要成分。科研人员从大肠杆菌(E. colik12)中找到了合成PLP的关键酶A，通过基因工程构建了高产PLP的工程菌，流程如图甲所示。图甲中③过程后将工程菌置于含氨苄青霉素的培养基中培养，对筛选出的4个工程菌菌落进一步检测，结果如图乙所示。请回答下列问题：

       

(1)DNA复制时，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖即___________(填“5′→3′”或“3′→5′”)的方向合成互补链。②过程是基因工程的核心工作，需要用到的两种工具酶为___________。
(2)由图乙分析，只有________号菌落才是高产PLP的工程菌菌落，原因是________。
(3)蔬菜是提供维生素的重要食物来源。科学家利用苏云金芽孢杆菌和具有防病等优良性状的枯草芽孢杆菌进行原生质体融合，构建了多功能工程菌，其对小菜蛾的杀虫率在59%以上，对防治蔬菜病虫害具有重要意义。
①苏云金芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌的细胞壁的主要成分是___________，可选择___________(填“纤维素酶和果胶酶”“蛋白酶”或“溶菌酶”)对这两种细菌进行去壁处理，从而获得两者的原生质体。
②从培养基类型(物理性质)来讲，如何对工程菌进行筛选与扩大培养？___________。

6 . 转基因动物生物反应器是利用动物细胞、组织或器官制备各种外源基因表达产物的装置系统。有些天然蛋白质不符合人类生产和生活的需要，需要运用蛋白质工程技术，如图是利用蛋白质工程等技术获得转基因动物生物反应器的流程图。回答下列问题：
   
(1)图中蛋白质工程基本思路中X是____________________； 基因表达载体除目的基因和标记基因外，还必须有___________等，构建成功后需要利用____________技术将其导入羊受精卵细胞。
(2)乳腺生物反应器的目的基因在乳腺中特异性表达，产物只存在乳汁中，但获得乳腺生物反应器需要在进行早期胚胎移植前进行___________鉴定等，而膀胱生物反应器指导目的基因表达产物分泌在尿液中，与乳腺生物反应器相比，优点有_____________________（答出2点）。

7 . 异丁醇具有燃值高、能量密度高等优点，其开发和利用对优化我国能源结构和保护环境有非常重要的意义。科研人员构建了一种表达载体pUC18（如图1）导入酵母菌，用于过量表达ILV2、ILV5、ILV3、AR010基因，以期实现大规模生产异丁醇。图2是酵母细胞中葡萄糖代谢产生异丁醇、乙醇和乙酸的示意图，其中基因ADHs和ALDs分别控制E酶和F酶的合成。回答下列问题：
      
(1)将基因ILV2、ILV5、ILV3和AR010依次插入到质粒上的目的基因插入位点，选用高表达启动子pTEF1和____________作为调控序列。pTEF1是_____________识别并结合的位点。
(2)科研人员先将pUC18转化到大肠杆菌细胞中，以便筛选、保存和扩增重组质粒。重组质粒上的____________（填“真核”或“原核”）生物复制原点使pUC18能在大肠杆菌中扩增。已知氨苄青霉素抑制细菌细胞壁的合成，pUC18中氨苄青霉素抗性基因的作用是____________。
(3)提取完整的重组pUC18并导入组氨酸缺陷型酿酒酵母细胞中，将菌株接种在培养基中以获得单菌落，该过程称为微生物的_____________培养。除必要的营养物质外，该选择培养基中需要添加的物质是____________。
A．组氨酸                    B．氨苄青霉素                    C．琼脂
(4)根据图示酵母细胞葡萄糖的代谢途径，为了进一步提高异丁醇的产量，应对基因____________进行改造使其表达产物减少。

8 . 1987年，科学家首次从小鼠的乳汁中获得了一种医用蛋白tPA（组织型纤溶酶原激活物），展示了用动物乳腺生产高附加值产品的可能性，开启了利用基因工程，让哺乳动物乳腺生物反应器（或乳房生物反应器）批量生产药物的新篇章。目前，科学家已经在牛、山羊等动物乳腺生物反应器中，获得了抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素和α-抗凝乳蛋白酶等重要的医药产品。回答下列问题：
(1)为了让目标产品在哺乳动物乳汁中形成，科学家需要将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的___________等调控元件重组在一起，通过___________的方法导入哺乳动物的受精卵中。
(2)若药用蛋白基因较少，常用___________技术快速扩增，扩增得到的产物常采用___________来鉴定。
(3)获得足量的药用蛋白基因后，不能直接将其导入受体细胞，而是要先构建基因表达载体，目的是___________。
(4)从哺乳动物乳汁中提取蛋白质，用相应的抗体进行___________，可检测药用蛋白基因是否翻译成了相应的药用蛋白。

9 . 重组人血小板生成素（rhTPO）是一种新发现的造血生长因子，下图为科学家通过培育出转基因山羊生产rhTPO的过程。其中编号①~⑨表示过程，A表示含有rhTPO基因的DNA，四种限制性内切核酸酶的识别序列及切割位点见下表，请回答下列问题：

限制酶	BamHI	BglⅡ	HindⅢ	XbaI
识别序列和切割位点	G↓GATCC	A↓GATCT	A↓AGCTT	T↓CTAGA

   
(1)②过程需要的限制性内切核酸酶是___________，不选用其余两种限制酶的原因是：__________。
(2)增强子是可增强基因转录的一小段特殊DNA序列，将其插入rhTPO基因的启动子中可提高rhTPO基因的表达量。但有人认为这样会引起基因突变，导致基因rhTPO表达的蛋白质氨基酸序列改变，你__________（填“认同”或“不认同”）这种观点，理由是__________。
(3)为了一次获得较多的卵子，可通过注射____________激素对供体母羊进行超数排卵处理；可从转基因动物分泌的乳汁中获得重组人血小板生成素，人们把这种转基因动物称为__________。
(4)利用转基因大肠杆菌（工程菌）不能生产有活性的重组人血小板生成素，这是因为__________。

10 . 青蒿素是黄花蒿叶片细胞的代谢产物，能杀死红细胞内的疟原虫，是非常有效的抗疟疾药物。目前可利用植物组织培养技术生产青蒿素。回答下列问题：
(1)植物组织培养技术中建立无菌体系非常重要，其中培养基需用____________法灭菌，对外植体则需进行____________处理。组织培养过程中获得愈伤组织的过程称为____________，研究人员发现愈伤组织中没有青蒿素，其根本原因是____________。可推测青蒿素是黄花蒿叶片细胞的____________（填“初生”或“次生”）代谢产物。
(2)植物组织培养的不同阶段需要换瓶培养，换瓶的主要目的有____________。欲探究不加任何激素、生长素用量与细胞分裂素用量的比值为1、比值大于1以及比值小于1，在组织培养中对芽和根形成的影响，请设计表格记录实验结果。组织培养过程除需及时调整培养基的成分外，还要控制的外界条件主要有__________。
(3)近来有科学家利用基因工程的方法在细菌（工程菌）中重建“植物代谢过程”，利用工程菌进行发酵生产大量植物代谢产物，该过程涉及到的变异类型是____________。与植物细胞工程生产植物稀有化合物相比，利用工程菌生产稀有化合物的优点在于____________（答1点）。
(4)经植物组织培养可再生出新的植株，目前还不能用类似方法获得完整的动物个体。克隆的动物，实际是通过___________来实现的。