25. CRISPR/CAS9基因组编辑技术源于细菌抵御噬菌体的机理研究。细菌被特定噬菌体感染后,细菌Cas2会随机切断入侵的噬菌体DNA双链,并将切下的一个DNA片段(原型间隔序列)插入CRISPR位点(由间隔序列和重复序列交替排列组成的基因序列)的重复序列中,构成新的间隔序列,形成“免疫记忆”。当同种噬菌体再次入侵时,由CRISPR位,点的新的间隔序列转录产生的crRNA便会将另一种蛋白质(如Cas9)准确带人到入侵者的原间隔序列DNA处,并将之切断,即“免疫灭杀”。CRISPR/Cas9基因编辑技术中,sgRNA(单向导RNA)是根据靶基因设计的引导RNA,准确引导Cas9切割与sgRNA配对的靶基因DNA序列,CRISPR/Cas9系统进行基因编辑时,对DNA序列中的原型间隔序列相邻基序具有较高的编辑效率,如图所示。回答下列问题:
(1)细菌Cas2基因表达Cas2的过程需要细菌提供
____________等原料,Cas2和Cas9在功能上都属于
____________酶,可催化
____________(化学键)水解。
(2)CRISPR/Cas9系统中的sgRNA与细菌体内的
____________功能相同,都可以与相应靶基因序列发生碱基互补配对。细菌利用该防御机制可以有效抵抗噬菌体的二次入侵,但是仍然会有部分噬菌体能够继续侵染已经获得免疫能力的宿主菌,原因可能是:
____________。
(3)CRISPR/Cas9基因编辑技术存在一定的脱靶效应:正常情况下,sgRNA通过20个核苷酸长度的引导序列与目标DNA序列发生碱基互补配对准确识别需要编辑的位点,然而有时会发生第18-20个碱基不匹配的情况,此时,Cas9可通过一个手指状的结构紧紧抓住错配区稳定住RNA-DNA双链,从而为Cas9切割DNA铺平道路,但这可能会导致Cas9在错误的基因位点切割双链DNA,从而引发潜在风险。请就如何降低脱靶效应,提出可能的思路:
____________。
(4)研究证实,人低氧诱导因子(HIF-1α)表达水平与肝癌的发生发展具有密切关系,HIF-lα在肝癌细胞中的表达水平明显高于正常肝细胞,使用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除HIF-1a基因为肝癌治疗提供了新途径。科研人员构建了靶向HIF-1α基因的CRISPR/Cas9重组质粒,并用重组质粒对肝癌细胞进行转染,利用其敲除肝癌细胞中的HIF-1α基因,并通过12孔板筛选获得了基因敲除的混合克隆细胞株,然后用HIF-1α表达诱导剂(CoCl
2)诱导相关细胞,提取蛋白,用Westernblot法(分离检测蛋白质的一种方法)检测HIF-1α蛋白的表达,以相应条带灰度值(越大)表示表达水平(越高)。下图为三类细胞HIF-1α蛋白的检测结果:
请尝试分析图示实验结果及结论:
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