19. phb2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物phb2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因,研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列(简称phb2基因),大小为0.9kb(1kb=1000碱基对),利用大肠杆菌表达该蛋白。下图1是phb2基因编码区序列以及两端需添加的能被相关酶识别的序列,图2为研究所用表达载体示意图,表格为有关的限制酶种类及识别序列和切割位点。回答下列问题。
限制酶种类 | SpeI | PvitⅡ | BamHI | XbaI |
识别序列 | 5'A↓CTAGT3' | 5'CAG↓CTG3' | 5'G↓GATCC3' | 5'T↓CTAGA3' |
(1)用PCR扩增phb2基因时,为了使PCR产物能被限制酶切割,以便构建基因表达载体,可以考虑在引物的
_____(填“3'端”或“5'端”)添加限制酶识别序列。据图可推断,扩增α链时需添加的限制酶识别序列以及所用引物的碱基序列是
_____(写出12个碱基并注明方向)。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时,可选用
_____(填“E。coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”)。
(2)构建的基因表达载体中需要使用大肠杆菌蛋白基因的启动子tac,其原因是
_____。
(3)将转化后的大肠杆菌接种在含
_____的培养基上进行培养,随机挑取菌落(分别编号为1、2、3、4)培养并提取质粒,用(1)中选用的两种限制酶进行酶切,酶切产物经电泳分离,结果如图3,
_____号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。
注:M为指示分子大小的标准参照物;小于0.2kb的DNA分子条带未出现在图中
(4)在筛选出成功导入phb2基因的大肠杆菌后,经多代培养仍能提取出phb2基因,你认为phb2基因是否已成功转化?你的观点及理由是
_____。