25. I、某种类型的白血病由蛋白P引发,蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解,药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理,需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P
△。P
△是缺失特定氨基酸序列的P,FLAG是一种短肽,连接在P或P
△的氨基端,使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合,但不影响P或P
△的功能。
(1)为构建重组载体,需先通过PCR特异性扩增P基因并能被EcoRI和BamHI识别,故用于扩增P基因的引物需满足的条件是
_______。
(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后,与编码FLAG的序列形成一个融合基因,如图甲所示,其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。重组载体除图中的启动子、P基因和终止子外,还需具有
_______。图中融合基因转录出的mRNA序列正确,翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确,但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析,出现该问题的原因是
_______。
(3)融合蛋白表达成功后,将FLAG-P、FLAG-P
△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质,分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测,检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P
△不能降解UBC,由123组结果的差异推测,药物A的作用是
_______;由②④组或③⑤组的差异推测,P
△中缺失的特定序列的作用是
_______。
II、FLAG抗体是一种单克隆抗体,其制备过程大致如下。
(4)请完善部分实验步骤:
①分别向多只同龄小鼠皮下注射经处理过的
_______,在实现初次免疫后,定期进行多次相同的免疫处理,并在最后一次免疫检测后获取小鼠血清,然后检测血清中FLAG抗体含量;
②从上述小鼠脾脏中分离出
_______细胞,与骨髓瘤细胞融合,置于96孔细胞培养板上,在适宜条件下培养;
③融合一定时间后,将杂交瘤细胞放入96孔酶标板中,检测其上清液中抗体水平。对抗体水平达标的孔中细胞克隆化培养;
④取克隆株注射至小鼠
_______进行培养,一段时间后,获得FLAG抗体。
(5)步骤①中检测血清中FLAG抗体含量的目的是
_______;在步骤②中96孔细胞培养板和在步骤③中96孔酶标板进行细胞培养的目的分别是
________。