【推荐2】同源重组技术结合tet^r-sacB双重选择系统可对基因进行敲除与回补，研究基因的功能。下图是科研人员利用该方法对大肠杆菌tacZ基因进行敲除与回补的相关过程，其中tet^r是四环素抗性基因，sacB基因（2071bp）是蔗糖致死基因，LacZ基因表达产物能将无色化合物X-gal水解成蓝色化合物。请回答下列问题：
   
(1)过程①PCR除需要加入Taq酶、dNTP、缓冲液、Mg²⁺外，还需加入______，所加dNTP的作用有______。
(2)为保证sacB基因和质粒2定向连接，设计引物P₁、P₂时，需在引物5'端添加限制酶_____的识别序列；过程②需要限制酶和________酶。
(3)过程③中，需先用Ca²⁺处理大肠杆菌，使其成为_______细胞。筛选导入质粒3的大肠杆菌时需在培养基中添加________。
(4)下图是对质粒3转化菌落进行PCR验证时的产物电泳结果，泳道4、5、7对应的菌株可能转化成功，判断的理由是______。过程⑤PCR中设计引物P₃、P₄时，需在引物5′端分别添加_______基因两端的同源序列。
   
(5)过程⑦中，在含有四环素和_____的培养基中出现了白色菌落，即为筛选出的敲除LacZ基因菌株。过程⑧通过同源重组技术结合tet^r-sacB双重选择系统可对LacZ基因进行回补，筛选LacZ基因回补菌株时应在培养基中添加_____。

【推荐3】CRISPR/Cas9是一种基因编辑技术，可用于基因敲除、定向基因突变和插入外源DNA分子。CRISPR具有靶向特异性，这是由两部分决定的，一部分是向导RNA和靶DNA之间的碱基配对，另一部分是Cas9蛋白复合体和一个短DNA序列（PAM序列），序列通常在靶DNA的3'末端作用。Cas9内切酶是一种RNA引导的内切核酸酶，用于通过产生序列特异性双链断裂进行基因组编辑，向导RNA则作用于体内一种称为RNA编辑的后转录修饰过程中。下图为借助CRISPR/Cas9基因编辑技术插入外源基因的过程图，回答下列问题：
   
(1)CRISPR是在细菌DNA中发现的一些重复序列，外来病毒DNA往往会被整合到这段序列附近并转录出向导RNA以引导Cas9内切酶切割病毒DNA。细菌细胞中的________也能起到类似Cas9内切酶的作用，使脱氧核苷酸之间的________断开。Cas内切酶________（填“会”或“不会”）切割细菌自身DNA，原因是________。
(2)在对目的细胞进行基因编辑时，需要构建含Cas9蛋白基因和设计好的向导RNA基因的________并导入受体细胞内，使其在细胞中表达出Cas9蛋白和向导RNA，并进入细胞核发挥作用。研究发现，即便向导RNA与目的序列完全互补，在PAM序列突变的情况下也无法引导Cas9内切酶，结合上图推测PAM序列的作用是________。
(3)真核细胞的DNA被切割后，会发生修复连接，便有可能实现连入供体DNA分子，也可能不会连入。若要利用CRISPR/Cas9技术敲除实验动物某个致病基因获得正常细胞，试提出操作思路：________。

【推荐1】中国苦荞富含黄酮类化合物等营养物质，在降血糖、降血脂等方面功效显著．查尔酮合成酶（CHS）是黄酮类化合物合成的关键酶，如图为将修饰后的CHS基因导入苦荞，培育高产黄酮苦荞品系示意图．

（1）要对培养基彻底灭菌应采用的灭菌方法是__．接种前，用灭菌后未接种的培养基培养一段时间，观察是否形成菌落，目的是__．
（2）接种前，外植体用__和0.1%的氯化汞溶液进行消毒后都需经无菌水清洗．接种后2﹣5天，若发现外植体边缘局部污染，原因可能是__．
（3）过程②叫做__，通过②和③过程能成功地把离体的苦荞体细胞能培育成植株，此技术所利用的原理是__．
（4）判断转基因苦荞培育是否成功，可比较转基因苦荞与普通苦荞的黄酮类化合物含量，也可通过凝胶色谱法分离测定细胞中CHS含量，由于CHS__，所以最先从色谱柱中洗脱出来，工业化生产中，可利用__技术以提高CHS的利用率而节约成本．

【推荐2】番茄光系统是由光合色素、脂类和蛋白质构成的复合物，高强度光照射后会受到破坏从而抑制光合作用。研究人员对番茄抗高光胁迫的系统调控机制进行了相关研究。
(1)高光胁迫时，位于____膜（结构）上的光系统，可以_____过量光能，将其转化为大量热能，破坏光系统。而番茄会通过NPQ（一种光保护机制）散失过多热能，避免高光胁迫造成的损伤。
(2)为研究V基因在高光条件下对NPQ机制的作用，科研人员利用病毒诱导基因沉默技术（VIGS技术）特异性地使V基因沉默。该技术的原理如下图1所示。

①结合信息，本实验中目的基因应选用_____的反义基因。该目的基因可通过___技术大量扩增，利用____ 酶可将其与病毒载体连接，构建重组病毒载体，转入特殊农杆菌中。
②应用该技术最终获得V基因沉默番茄，与野生型番茄经过相同高光处理，实验结果如图2，说明___________。
(3)番茄上部叶片经高光处理后，未受光照的下部叶片中V基因表达量会随之发生变化，从而使整株植物均可抵抗高光。推测上部叶片产生的HY5（一种转录因子）传递到下部叶片，导致V基因表达量的变化。科研人员利用不同的番茄植株进行嫁接实验（如下图）以验证上述猜测。

	1组	2组	3组
上部叶片	HY5沉默植株	野生型	Ⅰ_____
下部叶片	野生型	野生型	Ⅱ____
检测下部叶片V基因表达量

①在上表Ⅰ、Ⅱ横线处处完善实验设计，Ⅰ、Ⅱ的番茄植株应分别选用____、_____。（填写字母）
A.HY5过表达植株       B.HY5沉默植株       C.野生型植株
②若出现_____的结果，则证明上述推测成立。
(4)综上所述，高光照射后，番茄上部受光叶片产生的___会传递到下部未受光叶片，从而____V基因表达，激活NPQ机制，促进______，从而整株植物得以保护自身。

【推荐3】科研人员从耐盐植物中获得了耐盐基因，利用转基因技术将耐盐基因转入水稻细胞中，进而培育出了耐盐水稻新品系。下图表示构建耐盐基因表达载体的过程。请回答下列问题：

(1)据图分析可知，在构建的耐盐基因表达载体中，图中未标注出的必需元件有耐盐基因启动子，其功能是_________________________________。
(2)据图分析可知，在构建耐盐基因表达载体时，需要用______________对质粒进行切割，从而保证______________________________。
(3)常用农杆菌转化法将耐盐基因导入水稻受体细胞，根据农杆菌的感染特点，将耐盐基因插入Ti质粒的T-DNA上，经过转化作用进入水稻细胞，并将其插入水稻细胞______________上，从而使其遗传特性得以稳定维持和表达。
(4)受体细胞经诱导后形成愈伤组织的过程称为______________，进一步培育成幼苗，这体现了___________________________。检测转基因水稻是否培育成功可使用的最简便的方法是________________________________。

【推荐2】某二倍体豆科植物易感染白粉病而严重影响产量。该植物体内含有E和F基因， E基因决定花粉的育性，F基因决定植株是否存活。科研人员利用基因工程技术将抗白粉病基因随机导入EEFF植株的受精卵，获得改造后的EeFF和EEFf两种抗病植株（e和f分别指抗病基因插入E和F基因，e基因会使花粉的育性减半）。请回答下列问题：
（1）从E和F基因的角度分析，插入抗病基因，引起其发生的变异为___________。
（2）科研人员利用PCR技术检测抗病基因是否插入E（或F）基因中。甲、乙、丙3条引物在基因中的相应位置如图所示，PCR鉴定时应选择的引物是______，合成该对引物的前提是__________。

（3）若要获得更多的抗病植株，选择基因型为EeFF的植株 进行自交，F₁中抗病植株所占的比例为_________。
（4）为进一步研究这两对基因在同源染色体上的位置关系（不考虑基因突变和交叉互换），科研人员利用两种抗病植株作进一步实验。
实验方案：将EeFF和EEFf杂交获得F₁，选择基因型为_________的植株自交，观察F₂的植株抗病或不抗病性状的出现情况。
预期结果：
①若F₂中_____________，则两对基因分别位于两对同源染色体上；
②若F₂中____________，则两对基因位于一对同源染色体上。
（5）经上述研究，若结果为情况①，则F₂的抗病植株中，产生花粉育性都相同的基因型有______种。 若结果为情况②，则F₂的抗病植株中，产生花粉育性都相同的基因型为____________。

【推荐3】真核基因的转录激活因子是两种相对独立的蛋白质BD和AD组成的复合物，BD负责识别基因上游特定的DNA序列并与之结合（不同基因的BD不同），AD负责活化转录过程，两者单独作用时都不能启动转录。在科学研究中，往往利用该原理判断两种蛋白质能否相互作用。具体过程为：让BD基因与诱饵蛋白基因融合，让AD基因与待测蛋白基因融合，并让它们在酵母菌中表达出相应的融合蛋白，若诱饵蛋白与待测蛋白可以相互作用，则AD和BD就能充分接近形成复合物，并启动标记基因的表达。具体过程如图1：
   
(1)构建重组质粒甲时使用双酶切可以有效防止目的基因与质粒________；用EcoR I和Sal I双酶切后，检测样品1、2中是否含有重组质粒乙，电泳结果为图2，其中_______号样品为成功插入AD-待测蛋白基因的重组质粒。
(2)质粒导入前，原核细胞作为受体细胞一般先用Ca²⁺处理，与此类似，Y2H酵母菌母液需先用醋酸锂（LiAc）处理，推测其目的是________。与原核细胞相比，由于酵母菌具有_______能对蛋白质进行加工，故蛋白质的空间构象不受影响，这也是选择其作为受体细胞的原因之一。
(3)野生型Y2H酵母菌缺乏His3（组氨酸合成基因）和Mel1（半乳糖苷酶合成基因。已知在培养基中含有X-gal的情况下，半乳糖苷酶的分泌可使酵母菌落呈蓝色，否则呈白色）。将这两种基因作为标记基因导入Y2H酵母菌将其制备成受体菌，来判断诱饵蛋白与待测蛋白能否相互作用。重组质粒甲和乙导入受体菌后，将受体菌接种到______培养基中培养。若观察到受体菌菌落能存活且呈现______色，则说明诱饵蛋白和待测蛋白能相互作用。

【推荐1】某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建近组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FIAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响p或P△的功能。
(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是__________。为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的____________端（填“3'”或“5'”）。
(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是_______________。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是_______________。
   
(3)融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是_______；由________组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是___________。
   
(4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理可能是_________。

【推荐2】1965年中国科学家人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，摘取了人工合成蛋白质的桂冠，下图是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。回答下列问题：
             
(1)质粒上ori序列的碱基特点是______比值较高，图示胰岛素基因的转录以______链作为模板。
(2)在设计PCR引物时最好在引物的______端添加限制酶______的识别序列，PCR反应体系中引物的延伸需要TaqDNA聚合酶，此酶需要______（离子）的激活。
(3)生产过程中目的基因是利用胰岛B细胞中的mRNA反转录得到的胰岛素基因，不直接使用细胞中酶切获得的胰岛素基因的原因是________________________。
(4)科学家运用大引物PCR定点突变技术对胰岛素第28位氨基酸实现了替换，获得了速效胰岛素类似物产品。相关原理如图所示。
①第一次PCR至少需要______个循环才能获得相应的大引物模板，第二次PCR应选用大引物两条链中的______（填“A”或“B”），若第二次PCR计划循环n次，至少需要大引物______个。
②Ʋ半乳糖苷酶可以分解无色的Xgal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将转化后的大肠杆菌接种到添加了______的培养基上，若观察到菌落呈现白色，则表明________________________。

【推荐3】野生茄子具有耐盐基因StP5CS。研究人员扩增StP5CS 基因并双酶切该基因和改造后的中间载体pCAMBIA1301 ，经DNA 连接酶连接酶切产物，最终得到下图1所示的植物表达载体pCAMBIA1301—StP5CS。将该植物表达载体导入植物细胞进而获得了耐盐植株。回答下列问题：
       
(1)提取茄子幼嫩叶片的总RNA，在 _____________ 的催化下合成cDNA，再通过PCR技术扩增StP5CS基因。PCR利用   ____________ 的原理。
(2)扩增StP5CS 基因的上游引物为 ZHPs: 5'-CACATTTCTGCTCCTACATT-3'，下游引物为ZHPa :5'-CTTCCTAAATACACAACTGGAT-3'，   两种引物中C+G 的比例保持一致主要是为了保证 _____________ 。StP5CS基因PCR扩增的每次循环分为3步，在循环前常要进行一次94℃、5min预变性，其目的是 ______________。
(3)构建耐盐基因StP5CS 表达载体时，用限制酶BamH I和SmaI切割质粒pCAMBIA1301，15 min 后需将温度从36℃升高至65℃左右并保温20 min，目的是___________ ，从而终止酶切反应。mRNA合成方向是 图2是StP5CS基因示意图，为使其能正确插入表达载体并成功表达，则图中P处的碱基序列应为 5'-______     -3'。
(4)若将该表达载体导入柑橘细胞中，常用_______________法，表达载体上的 Ori 可以保证其在柑橘细胞中能____________。