6 . 肾纤维化是所有肾脏疾病的共同病理特征，随着肾纤维化的进行性发展，患者的肾功能会逐渐恶化，最终导致肾衰竭。有研究发现，Pmepal（一种跨膜蛋白）在TGF-βⅠ型受体信号传导的控制中发挥作用。利用CRISPR/Cas9技术构建Pmepal基因敲除的TCMK1小鼠肾小管上皮细胞系，并探讨Pmepal基因敲除对TGF-β刺激下TCMK1细胞纤维化的影响，为研究Pmepal在肾纤维化模型中的作用提供细胞模型。回答下列问题：

       

(1)据图1、图2分析，sgRNA 识别序列选择在小鼠Pmepal基因组第2个外显子（E2）上（图2），序列为5'-GCCGACACAGCAGGCCAGG-3'，使用__________切割sgRNA基因及pX333质粒，使用__________将两个酶切产物进行连接，获得pX333重组载体。其中，pU6及pCAG序列均为启动子，其作用分别是__________、__________。
(2)将构建好的pX333质粒转染入TCMK1细胞48h后，若观察到细胞出现__________，则说明转染成功且基因成功翻译。
(3)进一步采用某技术分析出转染成功（阳性）的TCMK1细胞，并将其增殖培养，最终获得16个细胞克隆。根据__________序列，设计引物，对这些细胞的Pmepal基因中Cas9靶向位点序列进行PCR扩增，经测序分析发现，16个细胞克隆中，克隆4（KO-4）和克隆16（KO-16）的Pmepal基因Cas9 靶向位点出现序列突变（图3）。经分析，克隆4和克隆16的基因分别因发生了碱基的__________而突变。