1 . 木聚糖酶可用于提高饲料中非淀粉多糖在动物体内的消化率，进而提高动物的生长性能。如图表示利用基因工程培育转木聚糖酶基因（XynA）的毕赤酵母的实验流程，其中ori代表复制原点，Shble基因的表达产物使毕赤酵母具有博来霉素抗性。重组质粒中的限制酶识别位点均已标出。

(1)图中过程①运用的技术是______；与酵母菌体内的DNA聚合酶相比，该技术所用到的DNA聚合酶具有的显著特性是______。
(2)进行过程②时，切割含目的基因的DNA片段和质粒时用到限制酶EcoRⅠ、NotⅠ，同时使用这两种酶可获得较高的重组率，由此推测，限制酶EcoRⅠ、NotⅠ切割DNA时形成的末端______（填“相同”或“不同”），理由是______。
(3)图中过程③不能采用显微操作法，原因是酵母菌有坚硬的______（填细胞结构）。
(4)将通过过程③获得的毕赤酵母接种到含博来霉素的培养基上进行初步筛选，原因是______。

2 . 培育抗草甘膦转基因大豆时，首先需要构建UTR—CTP—EPSPS序列（UTR—前导序列；CTP—叶绿体定位信号肽序列；EPSPS—抗草甘膦基因）和pCAMBIA1300质粒的重组载体，构建过程如图所示。重组载体通过电转化方式导入大肠杆菌DH5R中，经测序验证后导入农杆菌菌株EHA105中形成转化的工程菌株，再转染大豆。回答下列问题：

(1)构建UTR—CTP—EPSPS序列与pCAMBIA1300质粒的重组载体过程中，进行PCR时需要在两种引物的_________端连接限制酶_________的识别序列，引物序列的确定应依据_________，PCR依据的原理是__________。
(2)重组质粒PTWGM1接入的UTR—CTP—EPSPS序列中，EPSPS基因与CTP绑定的目的是_________。利用质粒PTWGM1可以大量扩增UTR—CTP—EPSPS片段，是因为其结构中含有_________。
(3)质粒PTWGM1通过电转化方式导入大肠杆菌DH5R的关键是利用电脉冲在_________处打开通道，使得外源DNA能够顺利进入细胞内。要确定细胞电转化是否成功，需要在培养大肠杆菌的培养基中添加__________进行筛选。
(4)若要回收EPSPS片段，可将扩增产物通过电泳进行分离后，割下凝胶以回收扩增的EPSPS基因。在凝胶中DNA分子的迁移速率与_________（答出两点）有关。若除目标条带外，还出现了少量的小片段非特异性扩增带，原因可能是_________（答出一点）。

3 . 植物远缘杂交可能会造成核仁显性现象，即源于一个亲本的基因组沉默，而源于另一个亲本的基因组表达。现采用人工去雄授粉的方法，以萝卜（RR，2n=18）为母本、芥蓝（CC，2n=18）为父本进行杂交，并通过胚抢救（一种育种手段）得到6株F₁植株。回答下列问题：
(1)萝卜与芥蓝远缘杂交的后代一般不育，主要原因是_________。经胚抢救得到的6株F₁幼苗用_________处理，可使其成为四倍体，恢复其育性。
(2)若核仁显性使全部后代只表达萝卜或芥蓝一方的基因组，则上述6株F₁植株的表型可能有________（填“一种”“两种”“多种”或“都有可能”）。研究人员提取了亲本萝卜、芥蓝及F₁的总RNA并逆转录得到cDNA，以cDNA为模板用特定引物进行PCR，经1.5%琼脂糖凝胶电泳的结果如图所示。结合电泳图谱分析，核仁显性使F₁表达了_________一方的基因组。

(3)若对萝卜采用常规杂交育种，可培育出不同根形的品种。萝卜的根形由A、a和D、d两对常染色体上的等位基因控制，且独立遗传。现将两种稳定遗传的圆形萝卜进行杂交，F₁全为扁形；F₁自交，F₂有扁形、圆形和长形三种表型，已知同时含有A和D基因的个体表现为扁形。
①由此推测，F₂中圆形萝卜的基因型有________种，圆形萝卜自由交配，F₃中基因型为Aadd的萝卜所占比例为________。
②随机选取F₂中一个圆形萝卜，现欲鉴定其是纯合子还是杂合子，可选择表型为________的萝卜与其交配。若后代表型及比例为________，可证明其为纯合子；若后代表型及比例为________，可证明其为杂合子。

4 . 猪传染性胃肠炎病毒（TGEV，+RNA））是引起猪传染性胃肠炎的主要病原体，其核衣壳蛋白（N）保守性强，对病毒粒子的装配有重要作用。科研人员根据TGEV的N基因保守序列设计特异性引物和TaqMan探针，与pCold-Ⅰ质粒连接，构建重组质粒pCold-Ⅰ-N，建立针对N基因的荧光定量PCR检测方法，用于临床快速诊断。
(1)提取TGEV的RNA，在________酶的作用下获得cDNA，在PCR扩增时需要添加________种引物，引物的作用是________。
(2)PCR反应需要的温度条件如图1，98°C预变性5min的目的是______。引物、探针与模板的结合发生在图1的______阶段。

(3)实验中使用琼脂糖凝胶电泳法来鉴定PCR扩增产物，结果如图2，分析可知，目的条带大小约________bp。将目的条带回收后，利用限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ切割目的条带和pCold-Ⅰ载体，然后在DNA连接酶的作用下构建重组质粒pCold-Ⅰ-N。使用双酶切的原因是________。除N基因外，构建成功的pCold-Ⅰ-N还包括________等。

5 . 郭三堆，被誉为“中国抗虫棉之父”，他带领的团队成功培育出单价、双价转基因抗虫棉和三系杂交抗虫棉新品种。该团队经过2年左右的时间成功组建了一个完整的Bt杀虫基因。该基因能控制合成Bt杀虫蛋白，棉铃虫吃下Bt杀虫蛋白后，在其碱性环境的肠胃中迅速释放出核心蛋白，并与害虫肠胃中特殊受体结合，引起肠胃溃烂而死亡。回答下列问题。
(1)利用苏云金芽孢杆菌（简称Bt）合成的Bt杀虫蛋白杀死棉铃虫属于______防治，人和其他哺乳动物误食了Bt杀虫蛋白后不会中毒或死亡，原因可能是_______。
(2)该团队构建了可表达Bt杀虫蛋白的重组Ti质粒，该质粒的部分结构如图甲所示。

①在构建重组Ti质粒时需要用到的酶是______，目的基因应插入Ti质粒的______。
②为了确定Bt基因连接到质粒中且插入方向正确，需要进行PCR检测，______（填“能”或“不能”）选择F1和R1作为引物，理由是_________。
(3)该团队将Bt基因和胰蛋白酶抑制剂基因Cpti连在一起导入棉花细胞中，培育出既产生Bt杀虫蛋白又产生胰蛋白酶抑制剂的双价抗虫棉。图乙是2个基因融合的示意图，P2、P3两种引物的部分区域碱基互补配对是两个基因融合的关键，在设计引物时应把互补配对的碱基序列分别加在P2和P3的______端，得到的第一个Bt-Cpti基因是以引物______延伸的子链互为模板和引物形成的。

6 . 自交不亲和是一种广泛存在于植物中防止近亲繁殖、保持遗传多样性的重要性状。中国李属于蔷薇科李属树种，是典型的自交不亲和植物。研究发现，中国李自交不亲和性与S位点的基因型有关，机理如下图所示。

   

(1)控制中国李的自交不亲和性的基因有S₁，S₂，S₃，S₄… Sn等多种类型，以上复等位基因的出现是_________的结果，同时也体现了该变异具有___________特点。
(2)将图中基因型为S₁S₂和S₂S₃的亲本进行反交的子代基因型是_____________。
(3)自交不亲和果树S基因型的鉴定在栽培品种搭配和遗传育种中具有重要的指导意义。据此，科研人员采集了来自我国贵州省的20个李品种样本（如下表）。
表1.供试的20个李品种

1	张晟李	6	铜壳李	11	三月李	16	玫瑰皇后
2	红心李	7	麦黄李	12	携李	17	奥德罗达
3	姜黄李	8	青脆李	13	幸运	18	前卫红
4	清镇酥李	9	南方李	14	芙蓉李	19	黑宝石
5	盘江酥李	10	奈李	15	大红袍	20	秋姬李

   

①提取DNA后对S基因进行PCR扩增，S基因结构如上图，请选择合适的引物_____。
②对PCR 产物回收，通过琼脂糖凝胶电泳分析产物，结果如下图，根据结果分析红心李和幸运是否为杂交育种的适宜亲本？_______________。

   

③冰脆李组电泳后仅得到1根条带，推测此现象的原因可能为______________。
④进一步的研究表明，自交不亲和性与S-RNase 有关。S-RNase 是一种由花柱和柱头分泌的糖蛋白，当花粉管在花柱引导组织生长时，亲和与不亲和S-RNase 蛋白都可以进入花粉管。亲和的S-RNase在花粉胞质中被花粉SLF 蛋白识别并降解； 而不亲和的S-RNase被保留在胞质中发挥其毒性作用，引起花粉管的细胞程序性死亡而停止生长，表现出自交不亲和。现欲获得兼具玫瑰皇后和奥德罗达优点的新品系，试提供可行的实验思路_____________。

7 . 遗传学技术在突变检出领域中有着重要的贡献与作用。
(1)Muller-5技术常用于果蝇X染色体上突变的检出，已知果蝇棒眼对圆眼为显性，红眼对杏色眼为显性，且控制这两对相对性状的基因皆位于X染色体上。下图为利用Muller-5品系雌果蝇检测基因突变的过程图。不考虑交叉互换。

为检测出果蝇X染色体上是否发生了突变，F₁代需进行_____（填“自由交配”“自交”或“单对交配”）获得F₂代。现有某纯合致死突变基因被检出，则在F₂代中，最好选取性状为_____果蝇进一步研究该突变基因的作用。
(2)PCR扩增法可用于基因点突变的检出，其基本原理是，如果引物的3'端碱基与模板碱基不互补，则用耐热DNA聚合酶无法延伸。已知某变异果蝇品种在Badh2基因的EXON7区出现了一个8bp的碱基对缺失和三个位置的碱基替换（其他序列与野生型一致），为了检测该变异，现设计以下四条引物进行PCR（如图所示）。

除了题干中提到的引物、耐热DNA聚合酶和DNA模板外，PCR反应体系中还需添加_____。若在8bp缺失型的DNA样本中同时加入四条引物进行PCR扩增，实验结束后应使用_____技术对产物进行检测，且理论上可以得到_____种序列不同的DNA片段。
(3)在检出突变基因后，科学家往往利用基因工程的方式获得该基因对应的蛋白质并进行下一步研究。如图为构建重组质粒的流程示意图，在该过程中，应使用_____对质粒S进行酶切。将重组质粒通过转化导入亮氨酸合成缺陷细菌后，应使用_____（填“添加亮氨酸”或“不添加亮氨酸”）的选择培养基，同时挑取_____（填“有绿色荧光”或“没有绿色荧光”）的菌落进行进一步鉴定。

8 . 干扰素在体外保存相当困难，若将其分子上的一个半胱氨酸替换为丝氨酸，则可延长保存时间。科研人员利用PCR技术对干扰素基因进行定点突变。他们通过实验先在试管A中得到产物1，接着在试管B中得到产物2（已定点突变的干扰素基因），整个流程如下图。回答下列问题。

(1)PCR技术利用了_____原理。实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌，目的是_____。
(2)在PCR反应体系中加入引物的作用是_____。试管A中要得到产物1至少经过_____次循环。试管B中所需的下游大引物为产物1中的_____链。
(3)为了使定点突变的干扰素基因能在哺乳动物乳腺细胞中特异性表达，在构建该基因表达载体时应将该基因与_____等调控元件重组在一起，然后将该表达载体通过_____法导入哺乳动物的受精卵中。

9 . 人β防御索是一种由H基因编码的抗菌肽，抑菌谱广，可通过构建重组酵母菌及其发酵实现量产。
(1)为获得β防御素目的基因，研究人员利用致病细菌的脂多糖( LPS)刺激结肠癌细胞株提高防御素的表达量，提取总RNA，进一步进行____后，采用PCR扩增，将基因测序结果与Genebank公开数据进行比较，进而得到正确的目的基因。
(2)本实验选用毕赤酵母表达载体pPIC9K（如图甲所示），扩增目的基因时设计的一对引物（P_l和P₂）如图乙所示。

限制酶	识别序列及酶切位点
BglI	5'..... A↓GATCT ......3'
EcoR I	5'.... G↓AATTC .....3'
SnaB I	5' .... TAC↓GTA ..... 3'
Sac I	5' ... GAGAT↓C ....3'
AurI	5' .... C↓CTACC ..... 3'
Sal I	5' ..... G↓TCGAC ......3'
Not I	5' ..... GC↓GGCCGC ..... 3'

①本实验中引物的作用是___________。
②结合载体与引物，推测本实验中采用的一对限制酶是______________。采用双酶切法的优势是__________。
(3)毕赤酵母真核表达系统最大的优点在于，该体系可对目的蛋白______，直接表达出具有生物活性的蛋白。
(4)重组毕赤酵母合成的β防御素在面包制作中还具有局限性。因其与哺乳动物糖蛋白链结构的差异存在抗原性，作为防腐剂添加，有引起机体免疫反应造成过敏的危险。请结合已有的基因工程和蛋白质工程知识给出改良思路去除上述β防御素的糖链结构。______________

10 . 脊髓性肌萎缩症（SMA）是婴幼儿中常见的致死性常染色体隐性遗传病，由位于5号染色体上的运动神经元存活基因1（SMN1）突变所致。SMN1的致病性突变包括基因内某段长序列缺失以及微小突变两种类型。未发生长序列缺失的SMN1基因的拷贝数可通过PCR测定，而发生长序列缺失的SMN1基因不能通过PCR扩增得到。SMN1在人群中的拷贝数为0~4个，SMN1拷贝数为0个会导致SMA，基因型表示为“0+0”型；SMN1拷贝数只有1个为杂合缺失携带者，基因型表示为“1+0”型；两条5号染色体上各携带1个SMN1基因型为“1+1”型；2个SMN1位于同一条5号染色体上的杂合缺失携带者，基因型为“2+0”型；携带3～4个拷贝者基因型分别为“2+1”型和“2+2”型。微小突变（表示为1^d）是指基因中一个或几个核苷酸发生变化。与SMA有关的部分基因型中SMN1的种类、拷贝数及在染色体上的分布位置如下图所示。下列说法正确的是（       ）

A．SMN1基因内某段长序列缺失所属变异类型为染色体变异，而微小突变所属变异类型为基因突变

B．SMA患者的2条5号染色体上均没有正常的SMN1基因，而非SMA患者2条5号染色体上各含有1个正常的SMN1基因

C．若一个父母皆正常的SMA患者经检测为两条5号染色体SMN1基因某段长序列都发生了缺失，则其父母的基因型均为“1+0”型

D．若一对夫妇基因型分别为“2+0”型和“1+1d”型，则生一个女儿患病的概率为1/4