1 . 培育转基因生物时，首先要在体外对含有所需基因的DNA进行加工，其中包括将不同的DNA片段连接起来形成重组DNA。回答下列问题：
(1)图1中，HindⅢ、EcoRⅠ、BamHⅠ是3种不同的限制酶，且产生的黏性末端不同，GFP基因是绿色荧光蛋白基因。PCR扩增目的基因时，在两种引物的______（填“5′”或“3′”）端分别加上EcoRⅠ、BamHⅠ的识别与切割序列，该过程使用两种而不是一种限制酶的目的是______。

(2)图1获得的重组表达载体的标记基因是______。将筛选出的重组表达载体转染成纤维细胞，再利用该成纤维细胞进一步培育转基因动物。如何利用该成纤维细胞培育转基因动物，请简述实验思路：________。
(3)重叠延伸PCR技术采用具有互补末端的引物使PCR产物形成重叠链，通过重叠链的延伸将不同来源的片段重叠拼接在一起形成重组DNA，该技术成功的关键是重叠互补引物的设计。图2表示通过重叠延伸PCR技术拼接基因A和B的过程，步骤②得到的两种重叠产物中，目标产物是______，判断理由是______。其中步骤④加入的引物是______。与图1获得的重组表达载体相比，图中重叠延伸PCR技术形成重组DNA，不需要______酶。

2 . Caveolin-3（CAV3）是细胞质膜微囊蛋白，该蛋白主要定位在细胞膜中。某实验小组将CAV3基因插入到下图所示的质粒上的GFP（绿色荧光蛋白）基因下游，使两者共用同一个启动子形成融合基因，并将重组质粒导入到骨骼肌成肌细胞中。实验小组通过对细胞内绿色荧光定位筛选出稳定的细胞株，回答下列问题：

(1)构建重组质粒过程中需要的工具酶有____，将重组质粒导入骨骼肌成肌细胞的方法为____。
(2)为了筛选出成功转化的细胞株，应先将细胞置于含____的培养基中培养一段时间，并筛选出稳定的细胞株，然后再观察细胞中荧光蛋白的分布情况。现观察到2种不同类型的细胞：类型①绿色荧光分布在整个细胞中；类型②绿色荧光主要分布在细胞膜上，应筛选类型____（填“①”或“②”）的细胞，另外一种类型细胞出现的原因是____，最后再根据____可筛选出CAV3基因表达能力强的细胞株。
(3)为了进一步确定CAV3基因导入了受体细胞，可用限制酶切割重组质粒后对DNA片段进行电泳，电泳可根据不同DNA分子在____上的差异将其分离。

3 . 现有假单胞菌减毒活疫苗（Pp）和敲除了M基因的缺陷型假单胞菌减毒活疫苗（Pp－m），Pp只能预防白点病，研究者欲将外源抗原基因导入到Pp中表达，以构建能预防多种疾病的多联疫苗。已知含抗性基因的质粒存在安全性风险，现为获得无抗性基因但可通过其他方式达到筛选目的的质粒，并让该质粒携带抗原基因从而实现对多联疫苗的研制。

(1)图中是操作中使用的PBBR1质粒（kan⁺为卡那霉素抗性基因，该质粒上只有BamHI和SacⅠ限制酶识别位点）和M基因（M基因为假单胞菌在不含氨基酸的普通培养基上合成谷氨酸的必需基因），其中P₁－P₈为设计的引物；利用PCR技术扩增M基因，应选择____引物，利用PCR技术扩增不含卡那霉素抗性基因的PBBR1质粒并使其线性化时应选用____引物。
(2)图中右下方为供选择使用的限制酶及识别序列（箭头为限制酶的切割位点）。由于PBBR1质粒和M基因两端都没有相同的限制酶识别序列，应在设计上述两对引物时增加两种不同的限制酶识别序列，可选择____识别序列分别加在引物的5’端。
(3)利用上述PCR产物经相同的两种限制酶酶切和连接，将连接产物导入____（填Pp或Pp－m）中，将转化产物接种在____培养基上，挑选出能在培养基上生长的单菌落。
(4)提取上述菌落中的质粒，为防止抗原基因与质粒的反向连接，利用____限制酶处理质粒和抗原基因，将构建的重组质粒导入假单胞菌中以生产多联疫苗。

4 . 赤霉素（GA）与其受体GID结合形成GA-GID复合体，然后该复合体再与DELLA的结合，使DELLA蛋白降解，从而起到促进植物生长的作用。GAI蛋白是DELLA蛋白的一种。为探究GAI蛋白可以与GID发生相互作用的部位是氨基端还是羧基端，研究者别构建了含GAI基因不同片段和GID基因的表达载体，具体情况如图所示。回答下列题：

   

(1)根据GA对植物生长发育的作用推测，GAI蛋白的积累会___（填“促进”或“抑制”）植物的生长。
(2)若通过PCR技术使表达出的GID的氨基端带有一段标签短肽GST，则可采取___的措施，将所得产物连入载体，由此获得质粒1为使融合基因能与载体相连接，还需要在引物上添加相应的酶切位点序列，该序列应该位于短肽GST编码序列的___（填“”或“”）端。
(3)选用不同引物对GAI基因进行扩增，并利用（2）的方法使其可表达标签短肽His，最终获得质粒2（编码只含有GAI蛋白氨基端的肽链）和质粒3（编码只含有GAI蛋白羧基端的肽链）。将空质粒、质粒1、质粒2和质粒3进行不同组合后分别导入细胞，裂解细胞后收集到多种蛋白，将各组蛋白依次通过带有His抗体的介质，未含有短肽His的蛋白将被洗脱丢弃，然后利用抗原-抗体杂交（可出现杂交带）的方法进行分析，结果如表所示。鉴定时应使用___（填“GST”或“His”）抗体进行抗原-抗体杂交。据表分析，GAI蛋白的___（填“氨基”或“羧基”）端可以与GID发生相互作用。C泳道未出现条带的原因是___。

组别	A	B	C
空质粒	+	－	－
质粒1	+	+	+
质粒2	-	+	－
质粒3	-	－	+
有无杂交带	无	有	无

注：“+”代表加入，“-”代表未加入

5 . 中药材种子的鉴别主要依靠种子形态特征和显微特征，研究发现蒙古黄芪和膜荚黄芪种子在肉眼和光学显微镜下观察无法对其进行鉴别。特异性聚合酶链式反应（PCR）作为传统鉴别方法的补充，是一种依靠遗传信息进行鉴定的方法，具有稳定性高、特异性强等特点。回答下列问题：
(1)PCR扩增的原理是____________，进行PCR扩增时，选用引物的作用是____________。
(2)PCR循环之前，常要进行预变性，预变性的目的是增加____________的概率。复性时引物与模板链____________（填“5′”或“3′”）端的碱基序列通过互补配对结合，为了提高PCR扩增的特异性，适当提高复性温度，分析原因是____________。
(3)PCR的产物一般采用____________来鉴定。对蒙古黄芪、膜荚黄芪种子及其混伪品种子进行鉴定，如图表示采用蒙古黄芪特异性PCR引物扩增的结果．结果表明____________。

(4)对于PCR扩增后符合要求的产物，通常还需要进行基因测序，原因是____________。

6 . 啤酒酿造时，糖化过程中形成的高分子糊精不能被酵母菌利用，而葡萄糖苷酶能将其水解为葡萄糖，将葡萄糖苷酶（STA1）基因引入酵母中，可提高啤酒的发酵度。絮凝性是啤酒酵母的重要特性之一，良好的絮凝性便于将啤酒酵母从产品中分离出来，提高啤酒的品质，与絮凝性有关的基因为FLO5。图1是构建含FLO5基因和STA1基因表达载体的过程。回答下列问题：

(1)过程①所需要的酶为____，过程②为____过程，每次循环一般可以分为____三步，完成后常采用____来鉴定产物。
(2)若图2为扩增FLO5和STA1复合基因的过程，A、B、C、D为提供的四种引物，应选择的引物为____。

(3)啤酒酿造过程中需要使大麦种子发芽，让其释放淀粉酶，若不采用此方法，____也可达到相同的效果。糖化后的糖浆和啤酒花要经过蒸煮，蒸煮的目的是____。发酵结束后，若要将酵母菌从发酵液中分离出来，可采用的方法是____。

7 . 黑腹果蝇是遗传学中常用的实验材料。结合所学知识，回答下列问题：
(1)研究人员在黑腹果蝇中发现了一种新的体色突变体——黑条体，利用PCR技术对黑条体突变基因和野生型体色基因进行扩增，发现利用相同引物进行扩增，黑条体突变基因的扩增产物比野生型体色基因的扩增产物短，据此推测，黑条体基因形成的具体原因是______。黑条体突变型与野生型纯合个体杂交后，产生的子一代随机交配，得到的子二代中黑条体突变型的比例为_________，且黑条体突变型中性别比为_________，说明黑条体由常染色体上隐性突变基因控制。
(2)另有一种体色隐性突变体——黑檀体，若黑檀体中控制体色的基因碱基序列并未发生变化，但是基因的表达和个体的表型却发生了变化，这种现象称为__________。研究表明，导致黑檀体中控制体色的基因表达发生改变的根本原因如图1所示：

上述变化与图2中___________代表的变异类型相同。

(3)为判断两种体色突变基因的关系，将黑条体与黑檀体杂交，得到的子一代中没有野生型个体，说明___________________，但子一代随机交配，子二代中却出现了少数野生型个体，结合图3说明，子二代中出现野生型个体的原因可能是_______________________________________。

8 . 热原是由微生物产生的、能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。注射类药物或医疗器材的热原含量检测是评价药物安全的重要指标。
(1)热原能刺激免疫细胞分泌与发热相关的细胞因子（如IL-6）。ELISA利用IL-6抗体和IL-6特异性结合，可以实现对IL-6的定量检测（图1）。下列说法正确的有____________（多选）。

A．固相抗体和酶标抗体竞争性结合IL-6的相同活性位点

B．酶标抗体具有免疫学活性和酶活性，具有多个活性位点

C．实验需设置仅有酶标抗体或仅有上清液的两组对照实验

D．需给予足够长的时间使无色底物充分反应后检测光信号

E．反应体系中光信号越强则细胞上清液中IL-6含量越高

(2)现有检测方法中，免疫细胞存在来源少、稳定性差、灵敏度低等问题。因此，科研人员通过基因工程，将免疫细胞中参与热原反应信号通路的关键基因（TLR₄、MD₂、CD₁₄）转入HEK293T细胞系，构建热原敏感的细胞系解决该问题。原理如图2，回答下列问题。

①从免疫细胞中提取总RNA，经逆转录和PCR获得TLR₄基因，构建真核表达载体，完成上述过程需要用到的酶有____________。
②将基因表达载体通过显微注射技术导入HEK293T细胞，目的基因有机会整合到HEK293T的染色体，这种变异类型属于___________。
③提取表达绿色荧光蛋白的细胞DNA，利用引物组合____________扩增（图3），如果出现目的基因片段，初步证明TLR₄已整合到染色体上。

④利用同样的方式将MD₂-CD₁₄-红色荧光蛋白基因导入HEK293T的染色体。
(3)经检测，细胞传代培养后导入的基因能够稳定遗传，欲证明热原敏感细胞系可替代免疫细胞实现热原检测，还需设计哪些实验? ___________。

9 . 谷氨酸脱羧酶在植物生长发育和逆境胁迫中具有重要作用，OsGAD2是水稻中一种能编码谷氨酸脱羧酶的基因。南昌大学科研团队用CRISPR/Cas9技术获得了几个OsGAD2基因敲除的纯合突变体，发现敲除了OsGAD2的突变体水稻在株高、粒长和粒重上都有显著提高。回答下列问题：
(1)科研人员首先将OsGAD2基因编码区的片段和CRISPR/Cas9载体连接，得到重组载体，这个过程需要用到的酶是_____________。导入受体细胞后，载体上的OsGAD2基因片段可以转录出一段引导RNA序列（sgRNA），sgRNA可以和受体细胞中OsGAD2基因的相应位置（靶点）发生_____________，从而引导Cas9蛋白特异性诱导靶点发生碱基随机突变。若突变后的0sGAD2基因表达出的蛋白质比原来更短，可能原因是_____________。突变后OsGAD2基因往往会失去原有功能，所以重组载体也可以叫“OsGAD2基因敲除载体”，该载体的部分结构细节如下图所示。

(2)用农杆菌转化法将OsGAD2基因敲除载体导入愈伤组织细胞，将转化后的愈伤组织转接培养基上进行培养。为筛选出含有OsGAD2基因敲除载体的愈伤组织细胞，培养基中需要加入______________________。同时，加入抗生素还可以起到_____________作用。
(3)要检测是否成功诱变，最好选取下图中的引物_____________（填编号），以受体细胞染色体DNA为模板进行PCR，对扩增出的产物进行DNA分子测序。PCR每个循环有3个步骤，其中_____________这个步骤需要将温度降到50℃左右，其目的是_____________

10 . 科研人员从不同苏云金杆菌亚种中分离出对不同昆虫有特异杀毒作用的5种杀虫蛋白（Cry），提取5种Cry基因分别转化大肠杆菌。请回答下列问题：
(1)利用PCR获取和扩增Cry基因，依据的原理是______。在PCR扩增仪中自动完成后，常采用_______来鉴定产物。
(2)大肠杆菌培养基一般含有_____、水和无机盐等营养物质。实验结果表明，只有成功完成转化的大肠杆菌才能在含有氨苄青霉素的培养基上生长，推测最可能的原因是______。
(3)适宜条件下培养24h后，发现培养基上长满了菌落，对不同菌落的遗传物质进行PCR测序并比对，发现不同菌落之间的核苷酸序列存在明显差异，原因可能是_______。
(4)将不同的菌落进行克隆化培养后收集等量菌液，分别均匀的混在等量的人工饲料中，饲养相同数量的棉铃虫，28℃恒温箱中饲养3天后统计死亡的棉铃虫数。请完善实验方案中对照组的设置：____。