1 . 培育转基因生物时，首先要在体外对含有所需基因的DNA进行加工，其中包括将不同的DNA片段连接起来形成重组DNA。回答下列问题：
(1)图1中，HindⅢ、EcoRⅠ、BamHⅠ是3种不同的限制酶，且产生的黏性末端不同，GFP基因是绿色荧光蛋白基因。PCR扩增目的基因时，在两种引物的______（填“5′”或“3′”）端分别加上EcoRⅠ、BamHⅠ的识别与切割序列，该过程使用两种而不是一种限制酶的目的是______。

(2)图1获得的重组表达载体的标记基因是______。将筛选出的重组表达载体转染成纤维细胞，再利用该成纤维细胞进一步培育转基因动物。如何利用该成纤维细胞培育转基因动物，请简述实验思路：________。
(3)重叠延伸PCR技术采用具有互补末端的引物使PCR产物形成重叠链，通过重叠链的延伸将不同来源的片段重叠拼接在一起形成重组DNA，该技术成功的关键是重叠互补引物的设计。图2表示通过重叠延伸PCR技术拼接基因A和B的过程，步骤②得到的两种重叠产物中，目标产物是______，判断理由是______。其中步骤④加入的引物是______。与图1获得的重组表达载体相比，图中重叠延伸PCR技术形成重组DNA，不需要______酶。

2 . 从葡萄中提取的VImybA2基因，是花青素合成途径中的调节基因，该基因通过调节花色素苷的合成来决定葡萄果实的颜色。科研人员利用基因工程技术将VlmybA2基因导入双子叶植物番茄中。通过观察发现，转基因番茄植株的根、茎、叶、果实呈现紫色，花瓣为黄紫嵌合花色，颜色均不同于野生型番茄植株，图1表示的是构建的基因表达载体。回答下列问题：

(1)科研人员采用______法将基因表达载体导入番茄叶片细胞，并利用______技术将番茄叶片细胞培育成新植株。
(2)使用X-Gluc处理新植株的幼嫩叶片细胞，染色结果为______色的植株初步确定为转基因番茄。对目的基因进行PCR扩增时，利用VlmybA2基因序列内部特异性较______（填“高”或“低”）的区域设计______个引物。
(3)为了探究VImybA2基因对番茄不同器官花青素合成的影响，科研人员以野生型番茄植株为对照，选取转VlmybA2基因番茄的不同器官进行花青素含量测定，结果如图2所示。

上述结果说明______。据此，请你提出VlmybA2基因在植物基因工程中的应用前景______（写出一点即可）。

3 . 蒽是石油化工领域常见的一种多环芳烃化合物，对生物有毒且难以降解，会带来严重的环境问题。研究人员成功地从环境样品中分高得到能降解蒽的菌株A和B．回答下列问题：
(1)用于分离菌株A和B的固体培养基含有（NH₄）₃SO₄、MgSO₄、CaCl₂、NaH₂PO₄、K₂HPO₄、NaCl、FeSO₄、H₂O、琼脂、蒽等成分。其中为细菌生长提供碳源的成分是_____；该碳源在菌株A和B内的代谢产物可以参与合成_____（答出2种即可）等生物大分子。
(2)为鉴定菌株A和B，研究人员提取了菌株A和B的基因组DNA，并用PCR扩增16S rRNA基因。为了验证提取基因组DNA是否成功，采用二苯胺试剂鉴定，其原理是_____。在PCR扩增16SrRNA基因过程中，反应体系中引物的作用是_____。在PCR播环的3个步骤中，温度设置最高的是_____。
(3)菌株A和B降解蒽的过程相同，均由按严格顺序排列的一系列酶催化反应组成。为探究菌株A和B对蒽的降解能力，研究人员采用单独、混合接种（菌株AB接种量之比为1：1）方式开展实验（所有实验组接种总量一致）结果如表，由表可以看出菌株A和B混合接种比单独接种对蒽的降解效果更好，其原因可能是_____。

接种方式	单独接种		混合接种
	菌株A	菌株B
降解率（%）	41.7	20.9	65.2

4 . 萝卜是百姓喜爱的一种蔬菜，筛选优良性状，开展种质创新，对落实国家“种业振兴行动”计划，丰富“菜篮子工程”有重大应用价值。
(1)采用常规杂交育种，可培育出不同根形的品种。萝卜的根形由A、a和R、r两对等位基因控制，且独立遗传。现将两种稳定遗传的圆形萝卜进行杂交，F₁全为扁形；F₁自交，F₂有扁形、圆形和长形三种表型，比例为9：6：1。由题意可知，F₂中，长形萝卜的基因型为_________________,扁形萝卜中杂合子比例为__________________。
(2)利用返回式航天器搭载萝卜种子可使细胞产生基因突变。假设突变发生在某基因的内部，若编码区缺失一个核苷酸，则会引起编码的肽链__________________改变；若突变是一个核苷酸的替换，但没有引起编码的蛋白质功能改变，其原因可能是_________________（答出2点即可）。
(3)萝卜硫素具有抗炎、抗癌等生理功能，由黑芥子酶（Myr）水解前体物质形成。研究人员提取总RNA、逆转录形成cDNA,然后设计Myr基因特异引物，采用PCR方法扩增目的基因，经凝胶电泳后，发现有多条扩增带（其中也包含目的基因片段）。在不改变引物、PCR扩增体系和模板量的情况下、可采用_________________的方法，特异扩增目的片段。研究人员对扩增出的DNA片段进行了序列测定，序列信息见下图，推测其最多可以编码_________个氨基酸的多肽（终止密码子为UAA/UAG/UGA）。在多肽合成过程中，tRNA“搬运”氨基酸到核糖体上，氨基酸结合部位在tRNA的__________________端。

(4)研究人员希望采用Ti质粒上的T-DNA转移Myr基因，以便获得萝卜新品种。图中A、B、C、D、E为5种限制酶及其酶切位点，选用__________________（填字母）进行酶切，以使插入T-DNA中的目的基因正确表达；将转入目的基因的体细胞培养形成_________________，分化成植株，用于生产。

5 . 风肉一般是以鲜肉为原料，用食盐腌制后，经风干和微生物后发酵而成。在后发酵期，风肉含有耐盐的微生物。某实验小组为研究耐盐微生物的耐盐基因，设计实验如下。回答下列问题。
(1)实验小组为获得耐盐纯培养物A，使用的培养基应是__________（选填“普通培养基”或“选择培养基”），使用的接种方法是__________。
(2)为获得纯培养物A的耐盐基因X，实验小组应用纯培养物提取了DNA。在一定温度下，用二苯胺试剂对DNA进行检测，二苯胺检测DNA的原理是__________。获得PCR产物后，用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，影响DNA分子迁移速率的主要因素有__________（答出两点即可）。
(3)构建成功的表达载体将运用农杆菌介导技术转入某农作物，可获得耐盐转基因植株。与同种非转基因植株的染色体DNA序列相比，转基因植株的染色体DNA含有__________。
(4)为验证已获得的耐盐转基因植株具有耐盐性，需设计实验。写出实验思路_____。

6 . 水稻胚乳可作为生物反应器用于开发功能性产品。从猪瘟病毒抗原蛋白的预期功能出发，研究小组设计其预期的结构，推测应有的氨基酸序列，合成新的基因X。利用PCR技术对其进行扩增并连接启动子1，形成Z片段。把Z片段插入Ti质粒的T-DNA中，将构建好的基因表达载体导入水稻细胞完成转化，在胚乳中获得相应蛋白，最终将蛋白进一步加工为植物源猪瘟疫苗。相关信息如图所示。

回答下列问题。
(1)研究小组通过PCR扩增Z片段，延伸过程中，4种脱氧核苷酸在______催化作用下合成新的DNA链。酶切时，限制酶识别序列的重叠会降低切割效率。为构建基因表达载体，选择限制酶Hind Ⅲ和______进行切割，可使Z片段插入T-DNA的效率最高。为使基因能够正常表达，质粒上的N和J应都为______。
(2)为获得含蛋白X的水稻材料，首先诱导水稻种子脱分化形成______，然后通过______的侵染，使目的基因进入水稻细胞并完成转化，再将其转接到含特定激素的培养基上，诱导其______形成具有根、茎、叶的完整植株。
(3)为验证水稻中目的基因X是否表达（转录和翻译），分子水平上的检测方法有______（答出2点即可）。
(4)从猪瘟病毒抗原蛋白的预期功能出发，合成基因X，进而得到猪瘟疫苗的过程属于______工程的范畴。相较于大肠杆菌，水稻胚乳作为生物反应器制备疫苗的优势及理由有_____（答出1点即可）。

7 . 酵母菌是发酵工业的重要微生物，主要用于生产酒精。酒精不仅是化工和制药的重要原料，又可以作为清洁燃料，在环境保护上具有特别重要的意义。我国酒精生产主要使用淀粉为原料，但酒精酵母不具有淀粉水解酶的活性不能直接发酵淀粉，淀粉需先经过糖化等工序在淀粉酶的作用下被水解成葡萄糖后才能被利用。通过基因工程将黑曲霉的酸性α-淀粉酶基因转入酒精酵母中制成酒精酵母工程菌，以加快酒精发酵速度并提高淀粉原料的利用率和出酒率。
(1)酸性α-淀粉酶基因作为目的基因需要利用PCR技术快速扩增，PCR反应时需要提供目的基因模板、____。在常规PCR的每一轮扩增反应中，温度随时间的变化顺序是____。
A.94℃，60℃，72℃     B.60℃，94℃，72℃     C.94℃，72℃，60℃
(2)目的基因的载体—质粒pUC19，除具有复制原点、启动子、终止子，多个限制酶切割点外，还需具有____（如G418抗性）便于重组质粒的筛选。
(3)培养酒精酵母使用的是YPD培养基（每升含酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g），为检测重组质粒是否成功进入酵母细胞，在YPD培养基中加入200μg/ml的G418制成____（选填“选择”或“鉴别”）培养基。
(4)将待检测转基因酵母菌用无菌牙签点接在YNB平板上30℃培养3d后，用碘蒸汽熏染，观察____。
(5)取300μl成功的转基因酵母菌培养液上清液与300μl1%可溶性淀粉溶液混匀，60℃反应1h，100℃水浴煮沸10min灭活，用____同样操作作为对照。反应液中生成的葡萄糖用葡萄糖氧化酶试剂测定酶活性。
(6)将筛选出的酶活力高的三个转基因酵母菌株A、B、C在YPD平板上连续转移培养10次后，分别将原初菌株与转移5次和10次的菌株接种于YPD液体培养基，37℃振荡培养72h，测定上清液中的酸性α-淀粉酶活性，结果如下表。

品种/转移次数	酸性α-淀粉酶活性（U/ml）
菌种A	1.157
菌种A/5次	0.908
菌种A/10次	1.099
菌种B	0.919
菌种B/5次	1.103
菌种B/10次	0.806
菌种C	1.478
菌种C/5次	0.695
菌种C/10次	0.453

上述数据表明，菌株____不适合作为大规模发酵的工程菌使用，原因是____。

8 . 禽呼肠孤病毒（ARV）对养禽业的发展造成了巨大的威胁，研制疫苗防控禽呼肠孤病毒感染是既经济又有效的手段。近年来，我国的ARV基因工程疫苗的研制取得了较大进步，在该疫苗的研制过程中，σC蛋白基因成为候选基因。请回答下列问题：
(1)ARV是RNA病毒，为获得控制σC蛋白合成的DNA片段，可以利用病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是_________，再通过_________技术扩增相应的DNA片段。
(2)为了确保能准确得到σC蛋白基因，在设计PCR引物时必须根据σC蛋白基因两端的_________来进行。PCR过程每次循环分为3步，依次是_________。
(3)活载体疫苗是最具发展空间的疫苗之一。科研人员通过基因工程构建了能表达σC蛋白基因的重组减毒沙门菌，构建的基本流程包括四个环节：获取σC蛋白基因；_________；将σC蛋白基因导入减毒沙门菌；_________。
(4)将重组减毒沙门菌注射到雏鸡体内，重组减毒沙门菌表达的σC蛋白作为_________引起机体产生特异性免疫。为保证疫苗接种安全和效果稳定，在应用时需考虑疫苗接种的_________。

9 . 我国是世界产棉大国，棉花产量占世界总产量的1/4。但是棉花病虫害非常多，尤其是虫害，直接影响了棉花的产量。转基因抗虫棉的研发成功，为棉花的增收做出了巨大的贡献。回答下列问题：
(1)转基因抗虫棉所需的杀虫基因，可用PCR技术大量扩增。扩增过程中需要将温度冷却至55～60℃，目的是____________。获得大量杀虫基因后，还需利用两种酶构建基因表达载体。为了使杀虫基因和质粒能正确地成功拼接，一般操作方法是____________。
(2)将杀虫基因导入棉花细胞有多种方法，我国独创的方法是____________，另外还可以利用农杆菌转化法让另杀虫基因的遗传特性在棉花细胞里得以稳定维持和表达，理由是____________。
(3)杀虫基因导入棉花细胞后，可利用放射性同位素标记的目的基因的DNA片段作为____________，目的是检测____________。若是利用抗原一抗体杂交技术，结果显示出杂交带，则说明____________。
(4)除了上述的分子检测外，有时还需要进行个体生物学水平的鉴定。简述在个体水平鉴定杀虫基因是否成功表达的实验思路：____________。

10 . 某研究团队从沙漠野生柽柳中克隆出了一个耐盐碱基因TcSR1。该团队用限制酶切割目的基因TcSR1，用限制酶BamHⅠ切割质粒载体V3，两种限制酶的识别序列及酶切位点如图所示，经过体外重组和转化，最终获得了能够在盐碱地生长的杨树新品种。回答下列问题：

(1)使用______技术在体外扩增耐盐碱基因TcSR1，扩增时需要______种引物。基因TcSR1不直接导入杨树细胞，原因是____________(答出两点即可)。
(2)用限制酶BalⅡ切割目的基因和用限制酶BamHⅠ切割质粒载体V3后，再用______________酶处理，以构建基因表达载体，该表达载体不能够被BalⅡ或BamHⅠ识别并切割，原因是_______________________。
(3)将目的基因导入杨树细胞，培育后筛选转化阳性的植株。若要检测杨树植株中目的基因TcSR1是否发生转录，可采用_____技术，需要将______________片段制成探针，通过检测放射性达到目的。
(4)为进一步研究转基因杨树的耐盐碱机制，还需要进一步开展研究，实验思路是通过_________技术获得大量转基因植物，然后________________。