1 . 甜菜是我国重要的糖料作物之一。为提高甜菜的光合效率和产量，科研人员构建了携带SBPase基因（编码卡尔文循环的关键酶）的表达载体（图1），通过基因工程对甜菜进行遗传改造。回答下列问题：

(1)构建表达载体并导入农杆菌：获取目的基因后利用PCR技术进行扩增，经凝胶电泳鉴定后，回收其中包含目的基因的DNA片段。然后使用限制性核酸内切酶切割___________，将带有黏性末端的酶切产物纯化回收后，用______________连接。图1基因表达载体中没有标注出来的基因结构是_____________（填一个即可）。经过一系列步骤后，将测序正确的重组质粒导入农杆菌。
(2)获取抗性植株：将含有重组质粒的农杆菌与甜菜叶柄共培养一段时间后，先将外植体放在含有羧苄霉素和头孢霉素的培养基中初步培养，目的是______________，再转入含有_____________的筛选培养基中获得抗性植株。此过程中使用抗生素时需要注意的事项是_____________________。
(3)为从分子水平上检测抗性植株是否含有目的基因，对抗性植株进行PCR后检测，检测结果如图2。CK⁺组是选用含_______________的质粒作为阳性对照。

(4)取阳性无菌苗叶片提取总RNA，将RNA逆转录成cDNA，再以cDNA为模板，利用目的基因引物进行PCR以检测________________。

2 . 自然界中很少出现蓝色花，天然蓝色花产生的主要原因是花瓣细胞液泡中的花青素在碱性条件下显蓝色。我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因（idgs）及其激活基因（sfp）构建了如图所示的基因表达载体，通过农杆菌转化法导入白玫瑰中、在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝。

(1)靛蓝合成酶基因（idgS）及其激活基因（sfp）可利用DNA杂交技术从____中获取。
(2)构建基因表达载体时往往需要用同一种限制酶切割目的基因和载体，原因是____。
(3)据图可知，idgS基因插入Ti质粒时应使用的限制酶是____。经____连接后，除了会产生基因表达载体以外，还会有一些特殊的DNA，如____（至少答两种）。
(4)sfp和idgS基因的表达是____（填“独立进行”或“相互关联”）的。
(5)若受体白玫瑰细胞不变蓝，可能的原因是____。在目的基因的检测和鉴定过程中、通过PCR技术可检测____。

3 . 角蛋白酶（KerA）是降解角蛋白的酶类，在饲料工业中具有较大的应用前景，但天然菌株产酶量低限制了其推广应用。为了获得高效表达的KerA工程菌，研究者分别构建了大肠杆菌和毕赤酵母工程菌，并实现了异源表达。下图1为含KerA基因的外源DNA、质粒的有关信息，EcoR1、BamH1、Sal1、Xho1均为限制酶，Kan^r、Tc^r分别为卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因。请回答下列相关问题：
(1)为了获取KerA基因，从天然菌株中提取相应的DNA片段，再通过PCR技术大量扩增，PCR技术的原理_____，前提是_____。

(2)为了形成合适的重组质粒，应该选用_____和_____限制酶切割外源DNA和质粒DNA．
(3)重组质粒导入受体细胞的成功率很低，需经筛选才能获得导入成功的受体细胞。结合图1所获得的重组质粒分析，应选择具有_____特点的细胞作为受体细胞，才有利于后续的筛选。
(4)将目的基因导入大肠杆菌时，常出现三种情况：未转化的细菌、含空载体（普通质粒）的细菌、含重组质粒的细菌。下图是KerA基因重组质粒的“工程菌”的筛选示意图：
下图2中的_____和_____（选用“A/B/C/D/E”字母作答）菌落为含有目的基因的“工程菌”。

(5)KerA基因在大肠杆菌和毕赤酵母工程菌是否能实现异源表达，需要用_____技术检测，若在二者细胞中都能实现表达，从分子水平上分析原因是_____，并且它们体内转录和翻译的过程或机制相同。但经研究发现，只有毕赤酵母工程菌表达合成的KerA可直接投入使用，分析其原因是_____。
(6)KerA在60℃以上时热稳定性差，限制了该酶的应用范围，研究人员在KerA的末端插入半胱氨酸，这不仅对酶活性影响小，且大大提高了其热稳定性。其运用到的这种现代生物技术为_____。

4 . 遗传毒性物质常存在于被化学物质污染的水体，可损伤生物的DNA，严重威胁人类健康。研究人员通过基因工程改造大肠杆菌，以期筛选对遗传毒性物质反应灵敏的工程菌株，用于水质检测。
（1）大肠杆菌DNA中存在可被遗传毒性物质激活的毒性响应启动子序列。将毒性响应启动子插入图1所示表达载体的P区，获得基因工程改造的大肠杆菌。当改造后的大肠杆菌遇到遗传毒性物质时，RNA聚合酶识别并与______结合，驱动噬菌体裂解基因（SRR）转录，表达产物可使大肠杆菌裂解。
（2）研究人员选取启动子sul准备与图1表达载体连接。图2显示了启动子sul内部存在的酶切位点，箭头表示转录方向。

①据图1、2信息，克隆启动子sul时，在其A端和B端应分别添加限制性内切酶______的酶切位点，从而确保启动子sul可与已被酶切的表达载体正确连接。
②将重组表达载体导入大肠杆菌，置于含有______的选择培养基中进行筛选、鉴定及扩大培养，获得工程菌sul。
（3）研究人员陆续克隆了其他4种启动子（rec、imu、qnr、cda），分别连入表达载体，用同样的方法获得导入重组载体的工程菌，以筛选最灵敏的检测菌株。
①将5种工程菌和对照菌在LB培养基中培养一段时间后，检测菌体密度，结果如图3。图中结果显示________________________，说明工程菌在自然生长状态下不会产生自裂解现象。
②上述菌株在LB培养基中生长2h时加入遗传毒性物质，检测结果如图4。据图可知，5种工程菌均启动了对遗传毒性物质的响应，应选择工程菌____________作为最优检测菌株。

（4）下列关于该工程菌的叙述，正确的包括______________
A．该工程菌可能用于检测土壤、蔬菜中的农药残留量
B．该毒性响应启动子序列广泛存在于自然界所有物种中
C．其表达产物可裂解大肠杆菌，检测后的剩余菌液可直接倒掉
D．为长期保存该工程菌，应加入一定浓度的甘油冻存于-20℃

5 . 科学家将鱼抗冻蛋白基因转入番茄，使番茄的耐寒能力大大提高，可以在相对寒冷的环境中生长。质粒上有PstⅠ、SmaⅠ、HindⅢ、AluⅠ四种限制酶切割位点，下图是转基因抗冻番茄培育过程的示意图（amp^r为氨苄青霉素抗性基因），其中①~④是转基因抗冻番茄培育过程中的相关步骤，Ⅰ、Ⅱ表示相关结构或细胞。请据图回答下列问题。

（1）在构建基因表达载体时，可用一种或者多种限制酶进行切割。为了避免目的基因和载体在酶切后产生的末端发生任意连接，在此实例中，应该选用限制酶____、___________进行切割。
（2）培养基中的氨苄青霉素会抑制番茄愈伤组织细胞的生长，要利用该培养基筛选已导入含鱼的抗冻蛋白基因的番茄细胞，应使基因表达载体Ⅰ中含有________作为标记基因。
（3）研究人员通常采用______法将鱼抗冻蛋白基因导入番茄细胞内。通常采用_________技术，在分子水平检测目的基因是否翻译形成了相应的蛋白质。

6 . 虫草中的超氧化物歧化酶(SOD)具有抗衰老作用。研究人员培育了能合成SOD的转基因酵母菌。回答下列问题:

注:Hind Ⅲ和ApaLⅠ是两种限制酶,箭头表示酶的切割位置。
(1)将图中的重组DNA分子用Hind Ⅲ和ApaLⅠ完全酶切后,可得到____种DNA片段。图示的表达载体存在氨苄青霉素抗性基因,不能导入用于食品生产的酵母菌中,据图分析,可用________切除该抗性基因的部分片段使其失效,再用DNA连接酶使表达载体重新连接起来。 
(2)作为受体细胞的酵母菌缺失URA3基因,必须在含有尿嘧啶的培养基中才能存活,因此,图示表达载体上的URA3基因可作为____供鉴定和选择;为了筛选出成功导入表达载体的酵母菌,所使用的培养基____(填“需要”或“不需要”)添加尿嘧啶。 
(3)目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程,称为____。为了确定受体细胞中SOD基因是否转录,可用标记的____作探针进行分子杂交检测,分子杂交的原理是_____。 
(4)利用蛋白质工程获得活性更高的SOD时,需根据所设计蛋白质的结构推测其____序列,最终确定相对应的脱氧核苷酸序列并经____获得所需的基因。

7 . 科学家将人的生长激素基因与大肠杆菌的DNA分子进行重组，并成功地在大肠杆菌中得以表达。但在进行基因工程的操作过程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—，请据图回答：

（1）过程①所需要的酶是_________________
（2）在构建基因表达载体的过程中，应用限制酶______切割质粒，用限制酶______切割目的基因。用限制酶切割目的基因和载体后形成的黏性末端通过__________________原则进行连接。人的基因之所以能与大肠杆菌的DNA分子进行重组，原因是_______________________
（3）在过程③中一般将受体大肠杆菌用Cacl₂溶液进行处理，用以增大细胞壁的通透性，使________________________容易进入受体细胞。
（4）将得到的大肠杆菌B涂布在一个含有氨苄青霉素的培养基上，得到如图a所示的结果（圆点表示菌落），该结果说明能够生长的大肠杆菌中已导入了____________________，反之则没有导入；再将灭菌绒布按到培养基a上，使绒布表面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图b所示的结果（圆圈表示与图a中培养基上对照无菌落的位置）。与图b圆圈相对应的图a中的菌落表现型是__________________________，这些大肠杆菌中导入了________________。

8 . 用XhoI和SalI两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是（　　）

A．如图中两种酶识别的核苷酸序列不同

B．如图中酶切产物可用于构建重组DNA

C．泳道①中是用SalI处理得到的酶切产物

D．图中被酶切的DNA片段是单链DNA

9 . 苏云金杆菌能产生具有杀虫能力的(Bt)毒素蛋白。下图是转Bt毒素蛋白基因植物的培育过程示意图(为抗氨苄青霉素基因)，据图回答下列问题。

(1)将图中①的DNA用HindIII、BamH I完全酶切后，反应管中有_______种DNA片段。
(2)图中②表示HindIII与Bam I酶切、DNA连接酶连接的过程，此过程可获得_______种重组质粒；如果换用Bst I与BamH I酶切，目的基因与质粒连接后可获得_______种重组质粒。
(3)目的基因插入质粒后，不能影响质粒的_______。
(4)已知转基因植物中毒素蛋白只结合某些昆虫肠上皮细胞表面的特异受体，使细胞膜穿孔，肠细胞裂解，昆虫死亡。而该毒素蛋白对人类的风险相对较小，原因是人类肠上皮细胞_______ 。
(5)生产上常将上述转基因作物与非转基因作物混合播种，其目的是降低害虫种群中的抗性基因_____的增长速率。
(6)科学家发现转基因植株的卡那霉素抗性基因的传递符合孟德尔遗传规律。
①将转基因植株与___________杂交，其后代中抗卡那霉素型与卡那霉素敏感型的数量比为1：1。
②若该转基因植株自交，则其后代中抗卡那霉素型与卡那霉素敏感型的数量比_______。
③若将该转基因植株的花药在卡那霉素培养基上作离体培养，则获得的再生植株群体中抗卡那霉素型植株占____________%。