1 . 新型冠状病毒是一种RNA病毒，制作新冠疫苗的路径之一是：将新冠病毒的重要蛋白质基因导入某种工程菌细胞内，由工程菌表达新冠病毒蛋白，以此为主要原料生产新冠疫苗。这一过程需要进行基因序列合成、重组质粒构建和工程菌筛选等工作。联系所学相关知识，回答下列问题：
(1)分离得到的新冠病毒RNA稳定性较差，为增强其表达的稳定性，需要进行的操作是_____，然后以获得的产物切割部分片段作为_____，再通过_____技术使其大量扩增。
(2)获取工程菌的核心步骤是_____，这一过程所需的酶有_____；重组DNA中用于对目的基因进行筛选的序列为_____。
(3)工程菌选用大肠杆菌，其具有的典型优点是_____（答出两点）；为了增加重组质粒的导入成功率，一般须对大肠杆菌使用_____进行处理。

2 . 干扰素是动物体内合成的一种糖蛋白，可用于治疗病毒感染和癌症。回答下列问题：
(1)若想建立乳腺生物反应器大量生产干扰素，需借助基因工程的方法，常以哺乳动物的________________为受体细胞。为了保证干扰素基因只在乳腺细胞内表达，构建表达载体时必须在目的基因的前端加上________________。该方法不以原核细胞为受体细胞的原因是有活性的干扰素需要________________（填细胞器）的加工。
(2)干扰素体外保存相当困难，若将其分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸，就可在-70℃条件下保存半年。对蛋白质进行改造，一般通过对基因的操作来实现，原因是________________。
(3)科学家正试图利用基因工程对猪的器官进行改造以便获得对人无免疫排斥的可供移植的器官，所使用的方法是________________。
(4)试管婴儿是在体外进行受精后，在试管中进行胚胎培养。如果需要设计试管婴儿还可以对胚胎进行________________，最后选取健康的胚胎进行________________以保证生出健康的孩子。

3 . 甜菜是我国重要的糖料作物之一。为提高甜菜的光合效率和产量，科研人员构建了携带SBPase基因（编码卡尔文循环的关键酶）的表达载体（图1），通过基因工程对甜菜进行遗传改造。回答下列问题：

(1)构建表达载体并导入农杆菌：获取目的基因后利用PCR技术进行扩增，经凝胶电泳鉴定后，回收其中包含目的基因的DNA片段。然后使用限制性核酸内切酶切割___________，将带有黏性末端的酶切产物纯化回收后，用______________连接。图1基因表达载体中没有标注出来的基因结构是_____________（填一个即可）。经过一系列步骤后，将测序正确的重组质粒导入农杆菌。
(2)获取抗性植株：将含有重组质粒的农杆菌与甜菜叶柄共培养一段时间后，先将外植体放在含有羧苄霉素和头孢霉素的培养基中初步培养，目的是______________，再转入含有_____________的筛选培养基中获得抗性植株。此过程中使用抗生素时需要注意的事项是_____________________。
(3)为从分子水平上检测抗性植株是否含有目的基因，对抗性植株进行PCR后检测，检测结果如图2。CK⁺组是选用含_______________的质粒作为阳性对照。

(4)取阳性无菌苗叶片提取总RNA，将RNA逆转录成cDNA，再以cDNA为模板，利用目的基因引物进行PCR以检测________________。

4 . 自然界中很少出现蓝色花，天然蓝色花产生的主要原因是花瓣细胞液泡中的花青素在碱性条件下显蓝色。我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因（idgs）及其激活基因（sfp）构建了如图所示的基因表达载体，通过农杆菌转化法导入白玫瑰中、在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝。

(1)靛蓝合成酶基因（idgS）及其激活基因（sfp）可利用DNA杂交技术从____中获取。
(2)构建基因表达载体时往往需要用同一种限制酶切割目的基因和载体，原因是____。
(3)据图可知，idgS基因插入Ti质粒时应使用的限制酶是____。经____连接后，除了会产生基因表达载体以外，还会有一些特殊的DNA，如____（至少答两种）。
(4)sfp和idgS基因的表达是____（填“独立进行”或“相互关联”）的。
(5)若受体白玫瑰细胞不变蓝，可能的原因是____。在目的基因的检测和鉴定过程中、通过PCR技术可检测____。

5 . 角蛋白酶（KerA）是降解角蛋白的酶类，在饲料工业中具有较大的应用前景，但天然菌株产酶量低限制了其推广应用。为了获得高效表达的KerA工程菌，研究者分别构建了大肠杆菌和毕赤酵母工程菌，并实现了异源表达。下图1为含KerA基因的外源DNA、质粒的有关信息，EcoR1、BamH1、Sal1、Xho1均为限制酶，Kan^r、Tc^r分别为卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因。请回答下列相关问题：
(1)为了获取KerA基因，从天然菌株中提取相应的DNA片段，再通过PCR技术大量扩增，PCR技术的原理_____，前提是_____。

(2)为了形成合适的重组质粒，应该选用_____和_____限制酶切割外源DNA和质粒DNA．
(3)重组质粒导入受体细胞的成功率很低，需经筛选才能获得导入成功的受体细胞。结合图1所获得的重组质粒分析，应选择具有_____特点的细胞作为受体细胞，才有利于后续的筛选。
(4)将目的基因导入大肠杆菌时，常出现三种情况：未转化的细菌、含空载体（普通质粒）的细菌、含重组质粒的细菌。下图是KerA基因重组质粒的“工程菌”的筛选示意图：
下图2中的_____和_____（选用“A/B/C/D/E”字母作答）菌落为含有目的基因的“工程菌”。

(5)KerA基因在大肠杆菌和毕赤酵母工程菌是否能实现异源表达，需要用_____技术检测，若在二者细胞中都能实现表达，从分子水平上分析原因是_____，并且它们体内转录和翻译的过程或机制相同。但经研究发现，只有毕赤酵母工程菌表达合成的KerA可直接投入使用，分析其原因是_____。
(6)KerA在60℃以上时热稳定性差，限制了该酶的应用范围，研究人员在KerA的末端插入半胱氨酸，这不仅对酶活性影响小，且大大提高了其热稳定性。其运用到的这种现代生物技术为_____。

6 . 遗传毒性物质常存在于被化学物质污染的水体，可损伤生物的DNA，严重威胁人类健康。研究人员通过基因工程改造大肠杆菌，以期筛选对遗传毒性物质反应灵敏的工程菌株，用于水质检测。
（1）大肠杆菌DNA中存在可被遗传毒性物质激活的毒性响应启动子序列。将毒性响应启动子插入图1所示表达载体的P区，获得基因工程改造的大肠杆菌。当改造后的大肠杆菌遇到遗传毒性物质时，RNA聚合酶识别并与______结合，驱动噬菌体裂解基因（SRR）转录，表达产物可使大肠杆菌裂解。
（2）研究人员选取启动子sul准备与图1表达载体连接。图2显示了启动子sul内部存在的酶切位点，箭头表示转录方向。

①据图1、2信息，克隆启动子sul时，在其A端和B端应分别添加限制性内切酶______的酶切位点，从而确保启动子sul可与已被酶切的表达载体正确连接。
②将重组表达载体导入大肠杆菌，置于含有______的选择培养基中进行筛选、鉴定及扩大培养，获得工程菌sul。
（3）研究人员陆续克隆了其他4种启动子（rec、imu、qnr、cda），分别连入表达载体，用同样的方法获得导入重组载体的工程菌，以筛选最灵敏的检测菌株。
①将5种工程菌和对照菌在LB培养基中培养一段时间后，检测菌体密度，结果如图3。图中结果显示________________________，说明工程菌在自然生长状态下不会产生自裂解现象。
②上述菌株在LB培养基中生长2h时加入遗传毒性物质，检测结果如图4。据图可知，5种工程菌均启动了对遗传毒性物质的响应，应选择工程菌____________作为最优检测菌株。

（4）下列关于该工程菌的叙述，正确的包括______________
A．该工程菌可能用于检测土壤、蔬菜中的农药残留量
B．该毒性响应启动子序列广泛存在于自然界所有物种中
C．其表达产物可裂解大肠杆菌，检测后的剩余菌液可直接倒掉
D．为长期保存该工程菌，应加入一定浓度的甘油冻存于-20℃

7 . 为生产高效价疫苗和简化计划免疫程序，科学家研制出基因工程乙肝-百白破（rHB-DTP）四联疫苗，经各项检测均通过rHB-DTP四联疫苗制检规程的要求。其有效成分是乙肝病毒表面抗原、百日咳杆菌、白喉杆菌和破伤风杆菌的四种类毒素。请分析回答下列问题：
（1）为获取百日咳杆菌类毒素的基因，可从百日咳杆菌的细胞中提取对应________，在逆转录酶的作用下合成双链cDNA片段，获得的cDNA片段与百日咳杆菌中该基因碱基序列_____________（填“相同”或“不同”）。
（2）由于乙肝病毒表面抗原的基因序列比较小，且序列已知，获得目的基因可采用______，然后通过_____大量扩增，此技术的前提是已知一段目的基因的核苷酸序列以便合成引物。
（3）把目的基因导受体细胞时，科学家采用了改造后的腺病毒作为载体，写出你认为科学家选它的理由________________________。（写出2点）
（4）研究发现，如果将白喉杆菌类毒素20位和24位的氨基酸改变为半胱氨酸，免疫效果更好，请写出此种技术的基本流程_________________。
（5）实验证明，一定时间内间隔注射该疫苗3次效果更好，其主要原因是体内产生的______数量增多，当同种抗原再次侵入人体时，机体在更短时间内产生体液免疫的原因是_______________________。

8 . 下图为研究人员培育转黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因（CMV-CP基因）番茄的主要过程示意图（Kan^r为卡那霉素抗性基因）。请回答：

（1）若要使CMV-CP基因在番茄细胞中表达，需要构建基因表达载体，包含_____________、启动子、目的基因、终止子、复制原点。
（2）将CMV-CP基因导入番茄细胞后，培育的番茄植株具有抗CMV感染能力，这种现象属于植物的特异性免疫，该免疫过程中抗原是_____________。
（3）过程①接种的农杆菌细胞中，Kan^r及CMV-CP基因应插入到Ti质粒的________内部，该片段具有______________________的特点。
（4）③过程形成愈伤组织的培养基中应加入适宜浓度的_____________，其目的是_____________________________。
（5）过程③、④所需的培养基为_____________ （填“固体”或“液体”）培养基。过程⑤再生植株抗性鉴定时，引物序列设计的主要依据是_____________。

9 . 现代生物技术的发展越来越快，越来越贴近人们的生活。如转基因农作物、胚胎干细胞的利用、单克隆抗体、试管婴儿技术、生态工程等。根据所学知识，完成下列问题：
(1)在基因工程中，为了减少随花粉传播而造成的基因污染，可以将______________基因转移到受体细胞中，该基因的遗传方式______________（填“遵循”或“不遵循”）孟德尔遗传定律。
(2)科研人员利用经过埃博拉病毒免疫后的小鼠B淋巴细胞与小鼠的骨髓瘤细胞进行融合形成杂交瘤细胞，对上述杂交瘤细胞还需进行________________和_______________。经筛选后就可以获得纯净的单一品种抗体，可以用此抗体与药物制成“生物导弹”抗击埃博拉病毒。
(3)农杆菌能在自然状态下感染双子叶植物和裸子植物，当植物受到损伤时，其受伤部位的细胞会分泌大量的_____________________，从而使农杆菌移向这些细胞。农杆菌进入细胞后，可将Ti质粒上的_____________转移至受体细胞中，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。
(4)胚胎干细胞是由早期的胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞，所以胚胎干细胞应该来源于囊胚的________________，胚胎干细胞在功能上的特点是_________________。

10 . 虫草中的超氧化物歧化酶(SOD)具有抗衰老作用。研究人员培育了能合成SOD的转基因酵母菌。回答下列问题:

注:Hind Ⅲ和ApaLⅠ是两种限制酶,箭头表示酶的切割位置。
(1)将图中的重组DNA分子用Hind Ⅲ和ApaLⅠ完全酶切后,可得到____种DNA片段。图示的表达载体存在氨苄青霉素抗性基因,不能导入用于食品生产的酵母菌中,据图分析,可用________切除该抗性基因的部分片段使其失效,再用DNA连接酶使表达载体重新连接起来。 
(2)作为受体细胞的酵母菌缺失URA3基因,必须在含有尿嘧啶的培养基中才能存活,因此,图示表达载体上的URA3基因可作为____供鉴定和选择;为了筛选出成功导入表达载体的酵母菌,所使用的培养基____(填“需要”或“不需要”)添加尿嘧啶。 
(3)目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程,称为____。为了确定受体细胞中SOD基因是否转录,可用标记的____作探针进行分子杂交检测,分子杂交的原理是_____。 
(4)利用蛋白质工程获得活性更高的SOD时,需根据所设计蛋白质的结构推测其____序列,最终确定相对应的脱氧核苷酸序列并经____获得所需的基因。