1 . MDH2基因是拟南芥的抗镉胁迫基因，研究人员用巢式PCR技术扩增拟南芥的MDH2基因，以培育抗镉胁迫苜蓿。如图是PCR技术扩增拟南芥的MDH2基因过程示意图。回答下列问题。

(1)PCR反应体系需要加入模板、引物、________________________（答2种）、缓冲液、Mg²⁺等。巢式PCR技术相较于传统PCR技术的不同在于，巢式PCR技术的第二次扩增是在第一次扩增的产物内部进行，从而导致第二次扩增得到的DNA长度会更短，据图分析导致这种差异的原因是：________________________。
(2)绿色荧光蛋白基因（GFP）在紫外线或者蓝光的激发下会发出绿色荧光。研究人员将GFP与MDH2基因串联在质粒pXB94中的____________________之间，再导入苜蓿细胞中。GFP基因作为基因表达载体上的________________________________。
(3)导入MDH2基因的苜蓿细胞发生的变异属于________________。此后，还要利用________________原理将该细胞培育成一株抗镉胁迫植株，并在________________水平上对植株的抗镉胁迫能力进行检测。至此，整个育种工作才算结束。

4 . 近年来，卒中、脑梗、心梗等心脑血管病患病率持续上升。2023年11月国家卫健委发布《心脑血管疾病防治行动实施方案》推进对患者的救治和防病工作。
(1)卒中、脑梗、心梗等心脑血管病多是因动脉粥样硬化、血栓引起组织缺血所致。血栓由纤维蛋白构成，组织型纤溶酶原激活剂（t-PA） 由527个氨基酸构成（如下图）， t-PA 进入血浆后激活纤溶酶原， 使之转化成纤溶酶， 酶将沉积在血管内壁的纤维蛋白分解血栓裂解， 血管畅通。t-PA进入血浆后多与纤溶酶原激活剂抑制物形成复合物，很快失去活性，所以溶栓时要持续输入t-PA。然而， 大剂量t-PA易诱发出血。鉴于此， 有人提出通过抑制__________的活性， 以延长t-PA的活性。进一步研究显示，t-PA第84位的半胱氨酸替换为丝氨酸后的t-PA溶血栓更快， 这种改造的t-PA副作用更小。用生物化学手段直接改造“t-PA”蛋白质的结构，或是定点改造 t-PA 基因成为“突变基因”，通过基因工程等生物工程技术获取“突变的t-PA”。通过后者改造“t-PA”的主要优势是__________（写出一点）。

(2)已知t-PA基因碱基序列、丝氨酸密码子，可以通过人工合成目的基因（t-PA 突变基因） 、基因与质粒重组构建表达载体、表达载体进入受体细胞等一系列操作，最终获取“突变的t-PA”。这种基于t-PA的分子结构和功能的关系，通过一系列DNA 分子层面的操作获取人类所需蛋白产品的第二代基因工程过程又叫做__________。
(3)从上述人t-PA 基因获得第84位半胱氨酸替换为丝氨酸编码序列的t-PA突变基因，常借助PCR体外定点定向诱变获得。工作原理如图： 先合成包含突变碱基的两个突变引物。因突变点不位于基因端点，要借助 PCR 获得完整的t-PA 突变基因，还要合成两个正常引物1、2.参考图中正常引物1（5'-TACCAAGTGATCTGCAGA-3'）、t-PA 基因和 PCR 诱变过程原理图， 正常引物2 是5’___________……-3’（写出5’端的6个碱基即可）

(4)为了与质粒高效连接，t-PA突变基因两端应携带相应的限制酶识别序列。应将限制酶识别序列设计在两条正常引物的__________端。限制酶能够使 DNA 分子中特定部位的__________键断开。