22. 特异性重组的Cre/loxP敲除系统是首先利用同源重组将基因组上的靶基因替换为两端带有重组位点loxP的kan
R基因,然后由重组酶Cre识别loxP位点并发生重组反应,去除基因组上的kan
R基因,进一步利用质粒的温敏特性将其消除,从而实现靶基因的敲除。下图是研究人员利用Cre/loxP敲除系统敲除谷氨酸棒状杆菌argR基因(精氨酸代谢的调控因子),获得高产精氨酸菌株的过程,其中kan
R是卡那霉素抗性基因,cat是氯霉素抗性基因,HindⅢ、BanHⅠ是限制酶。请据图回答下列问题:
(1)①过程的原料是
_____,所需的酶是
_____。
(2)下列引物1、引物2用于扩增argR基因上游序列,引物3、引物4用于扩增argR基因下游序列,下划线序列是相关限制酶识别序列,则HindⅢ、BamHⅠ的识别序列分别是
_____、
_____。
引物1:5'-GTCGACGGTATCGAT
AAGCTTAGGACTCAAACTTATGACTTCACAACCA-3'
引物2:5-CGCCCTATAGTGAGTCGTATTGGGATTTAAGTTTTCCGGTGTTGACG-3'
引物3:5'-CTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGTTAATCGCTTGTTAATGCAGGCA-3'
引物4:5'-CGCTCTAGAACTAGT
GGATCCCAAAGCCTCGTGAGCCTTAATC-3'
(3)②过程(融合PCR)是采用具有互补末端引物,形成具有重叠链的PCR引物,通过PCR引物重叠链的延伸,从而将不同来源的DNA片段连接起来。下列引物5、引物6用于扩增两端含loxP的kan
R片段,引物5、引物6可分别与
_____、
_____(引物1、引物2、引物3、引物4)重叠从而实现不同DNA片段的连接。
引物5:5'-CGTCAACACCGGAAAACTTAAATCCCAATACGACTCACTATAGGGCG-3'
引物6:5-TGCCTGCATTAACAAGCGATTAACGCGCAATTAACCCTCACTAAAG-3'
(4)④过程将质粒3导入
_____态谷氨酸棒状杆菌,⑤过程在同源重组的作用下谷氨酸棒状杆菌株的argR基因被替换为
_____片段。
(5)⑥过程导入质粒4的目的是
_____。
(6)由于质粒4的温敏特性,⑦过程先在37℃条件下培养消除质粒4,然后用影印接种(A、B、C三个培养基中接种菌种的位置相同)培养验证其抗性,其结果如下图,则
_____是目的基因被敲除的目的菌株。