2 . 二倍体野生纯合红果番茄中控制三类色素代谢的关键基因为番茄红素合成酶基因PSY1、类黄酮合成调控基因MYB12和叶绿素降解酶基因SGR1，这三对基因独立遗传。科研人员利用CRISPR/Cas9多重基因编辑技术靶向敲除获得纯合的三重突变体（psy1 myb12 sgr1），并进行相应的杂交实验，具体过程如图。请回答下列问题。

F2表型	突变类型
红果	野生型
橙果	psy1单突变体
棕果	sgr1单突变体
粉红果	myb12单突变体
红紫果	myb12 sgr1双突变体
黄绿果	psy1 sgr1双突变体
黄果	psy1 myb12双突变体
绿果	psy1 myb12 sgr1三重突变体

(1)与传统的杂交育种相比，CRISPR/Cas9介导的多重基因编辑技术获得新品种的优势是_____。
(2)三重突变体（psy1 myb12sgr1）属于_____（填“显”或“隐”）性突变，这三类色素相关基因位于_____对同源染色体上。三重突变体因不能合成_____，使相关色素的合成或降解受到影响，从而呈现出绿色。
(3)F₂的粉红色番茄中纯合子所占比例为_____。为进一步确定该粉红色番茄的基因型，可将之与_____进行测交，若后代表现型及其比例为_____，可判断该番茄有两对基因均为杂合。
(4)F₂中红紫色和黄绿色番茄进行杂交，后代表现型及其比例为_____。
(5)为了创造出深紫红色的新品种，也可通过_____法将外源的甜菜红素合成相关基因导入红色番茄基因组中，然而，外源基因插入的随机性往往会影响后续番茄果色的杂交育种进程。下列外源基因的插入情况可能会导致上述问题发生的有_____（填选项字母）。
A．外源基因插入到PSY1的内部使PSY1结构破坏
B．外源基因插入到PSY1所在染色体的邻近位置
C．外源基因插入到PSY1所在染色体的非同源染色体上
D．外源基因插入到高度甲基化的染色体位点导致外源基因沉默

4 . β-地中海贫血是一种常染色体隐性遗传病， 我国南方这种遗传病的常见病因 是血红蛋白 β 珠蛋白基因（HBB）编码区 4 个碱基（3＇－CTTT －5＇）缺失。下图 1 是一种基因治疗 β-地中海贫血的技术路线，图 2 是图 1 过程③外源 DNA 导入 iPS 细胞 （诱导多能干细胞） 后， 在细胞内利用 CRISPR/Cas9 基因编辑系统和外源单链 DNA 及 DNA 自我修复系统进行基因治疗的主要过程。请据图回答问题。

(1)利用患者的成纤维细胞诱导形成 iPS 细胞，不仅可以避免在进行细胞移植时发生 _________ ，还因为 iPS 细胞能_________，可获得足够多的回输细胞。
(2)根据图 2 分析，在利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术进行基因修复时，需要根据_________ 设 计 2 种 gRNA；导入单链 DNA 作为修复模板的目的是_________ 。
(3)图 1 的过程③中， 研究人员将 gRNA 基因与Cas9 基因分别整合到不同的载体中，这是 因为整合到同一载体中会_________ ，不容易导入细胞。研究人员将 gRNA 载体、Cas9 载体 和单链 DNA 按一定比例与 iPS 细胞混和后， 对混合液进行瞬时高压电激处理，其目的 是_________ 。
(4)导入 iPS 细胞的 gRNA 基因和 Cas9 基因需要利用细胞中的_________ 催化合成 gRNA 和 Cas9 mRNA，后者指导合成 Cas9 蛋白， 并组装成CRISPR/Cas9 系统。图 2 中酶 B 的功能是 _________ 。
(5)为检测 iPS 细胞中 HBB 基因是否正确修复， 研究人员设计特异引物时， 最好将插入片 段（CTTT）或互补序列设计在引物的_________ 端。 在 PCR 时可_________ ，以提高引物结合 的特异性。

7 . DDX5基因在细胞周期调控、肿瘤发生等方面发挥重要作用。研究人员运用CRISPR-Cas9基因编辑技术对口蹄疫病毒易感的PK-15细胞株中的DDX5基因进行敲除，为后续研究DDX5基因在病毒感染中的作用提供基础。请据图回答下列问题。

(1)图1中，Ori是_______（酶）首先结合的核苷酸序列。构建CRISPR-Cas9表达载体时使用的工具酶主要有______。 结合对图2中CRISPR-Cas9技术原理的理解，图1表达载体中需要插入两种sgRNA基因，原因是_____。
(2)研究中先将CRISPR-Cas9表达载体导入大肠杆菌DH5a，再将菌液利用________法接种到加有________的细菌培养基上，待菌落长成后，直接挑取菌落加入到PCR反应系统中进行基因鉴定。PCR过程中不需要先提取细菌DNA的原因是______。
(3)研究中采用培养转化的大肠杆菌对CRISPR-Cas9表达载体进行扩增。与PCR相比，利用大肠杆菌进行目的基因扩增的优点有________、____________。
(4)取转化的PK15细胞悬液进行有限稀释，再接种到6孔培养板上，一段时间后对各孔内的细胞株进行DDX5蛋白检测，结果如图（其中B-actin是真核细胞骨架蛋白）。对细胞悬液有限稀释法的目的是________， 细胞培养时CO₂培养箱中充入的气体应是_______。 根据检测结果，敲除DDX5基因的细
胞株编号有___________。

8 . 科学家以含有16条染色体的酿酒酵母为原型，借助CRISPR-Cas9工具精确敲除了15个着丝粒和30个端粒中的DNA，使染色体末端-末端相连，最终构建出只含有一条功能性染色体的单染色体酵母菌株SY14。下列有关说法错误的是（       ）

A．单染色体酵母的染色体主要位于细胞核和细胞质中

B．CRISPR-Cas9工具与限制性核酸内切酶的作用效果类似

C．单染色体酵母进行酒精发酵时产生二氧化碳的场所是细胞质基质

D．单染色体酵母在细胞分裂时着丝粒数目最多可达两个