1 . In-Fusion技术是一项新型的无缝克隆技术。技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列（即同源序列，通常为15~20bp），然后用In—Fusion酶（能识别双链线性化DNA片段5'→3'末端16个碱基，并使其降解）处理即可实现无缝连接。它的操作步骤（如图）大致为：①利用PCR技术将质粒线性化；②PCR扩增出两端含线性化质粒同源序列的目的基因；③目的基因与线性化质粒同源区域在In—Fusion酶作用下形成重组质粒；④将重组质粒导入受体细胞。回答下列问题：

   

(1)过程①需要用到的酶是________，质粒线性化前后所含有的游离磷酸基团的个数分别为________个。
(2)过程③中，同源序列1、2中的碱基序列不同，这样设计的好处是______________________。
(3)过程④中，用________处理大肠杆菌，以便重组质粒导入受体细胞。重组质粒利用大肠杆菌细胞中的DNA聚合酶和________酶，实现完全环化。
(4)通过检测大肠杆菌的致死率可反映其转化后的抗性效果。在含________的液体培养基中培养一段时间，然后分别用显微镜计数法和稀释涂布平板法进行计数，计数结果分别是M、N，则致死率可用________×100%表示，此结果较真实值偏高。

2 . 野生型大肠杆菌能在基本培养基上生长，氨基酸营养缺陷型突变株只能在完全培养基上生长。下图为纯化赖氨酸营养缺陷型突变株的部分流程图，①②③④代表培养基，A、B、C为操作步骤，D、E为菌落。下列叙述错误的是（       ）
   

A．赖氨酸营养缺陷型突变株的出现是染色体变异的结果

B．紫外线处理可使大肠杆菌定向变异产生赖氨酸营养缺陷型菌株

C．图中D菌落为赖氨酸营养缺陷型菌株，E菌落为野生型菌株

D．①与③的成分区别仅仅是有无琼脂

3 . 土壤中的磷大部分以难被植物吸收利用的无效态（如磷酸钙等难溶态，在水中呈白色沉淀）存在，溶磷菌能够把无效态的磷转化为可被直接利用的可溶性磷。
(1)磷是植物生长发育的必需元素，可组成______等化合物。（填出2种即可）
(2)从土壤中筛选溶磷菌的一般步骤如下：
溶磷菌的分离：依次配备浓度为10^-3、10^-4、10^-5的土壤稀释液，分别取0.1mL均匀涂布于含难溶磷的固体培养基上培养2d。待菌落长出后挑取______的菌落，于基础培养基上采用______法进行多次纯化。溶磷菌的筛选：将分高获得的溶磷菌分别配制成菌悬液，接入已灭菌的含难溶磷液体培养基中做实验组，则对照组的培养基加入______，5d后测定培养液中可溶性磷含量。若接菌培养液可溶性磷含量为a，对照组可溶性磷含量为b，则菌株溶磷量为______。选择溶磷量最大的菌种为目的菌。
(3)将适量目的菌接入己灭菌的含难溶磷的液体培养基中培养，每天取样测定溶磷量和pH变化情况，结果见下图。

①结果表明目的菌分解难溶磷的能力呈现______的趋势。
②根据培养液的pH变化情况，可对目的菌的解磷原理作出的推测是________________________。
(4)请预期该溶磷菌在农业生产方面可能的应用________________________。

4 . 琼脂是一种多糖类物质，由于很少有微生物能将其降解而成为配制固体培养基常用的凝固剂之一。某实验室在处理一批已进行过微生物培养的废弃固体培养基时发现，培养基上的微生物几乎全部死亡，但在其中一个培养基上存在一个正常生长的细菌菌落，该实验室研究人员对此提出“该种细菌能利用琼脂”的假说。据此回答问题：
（1）若要证明该假说的正确性，应该在配制培养基时，选择以____________为唯一碳源的固体培养基进行培养，配制好的培养基需通过____________法进行灭菌。
（2）通过实验证明该假说是正确的，并且发现该琼脂分解菌能分泌脱色酶，分解糖蜜发酵废液的黑褐色色素。
①欲从获得的菌种中分离出分解黑褐色色素能力强的细菌，可在培养基中加入从糖蜜发酵废液中提取到的黑褐色色素，采用的接种方法是____________。适宜条件下培养一段时间，发现菌落周围形成圆形凹穴和透明圈，形成的原因是____________；应选择凹穴大且周围透明圈大的菌落进行扩大培养。
②由于该菌种在自然界中极为稀少，欲长期保存该菌种，可以采用____________法，具体操作是在3mL的甘油瓶中，装入1mL甘油后灭菌，然后将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在-20℃的冷冻箱中保存。
（3）实验中需要及时灭菌或消毒，才能保证实验结果的准确性，下列各项可以使用干热灭菌的是______（填标号）
A．实验者的皮肤                    B．培养基                    C．吸管                    D．金属用具       E．玻璃棒                           F．培养皿

5 . 请回答下列问题：
（1）获得纯净培养物的关键是______________ ，灭菌可杀死物体内外所有的微生物，包括______________，采用巴氏消毒法对牛奶进行消毒的优点是______________________ 。
（2）按用途分类，伊红美蓝培养基为______________ （选择或鉴别）培养基，培养基中的蛋白胨可为大肠杆菌的生长提供______________（营养成分）。将待灭菌物品放入高压蒸汽灭菌锅内，加上盖子，拧螺栓时要注意______________ ，使螺栓松紧一致，不漏气。
（3）临时保藏是先将菌种接种到试管的______________ 培养基上，待长出菌落后再放在4℃下保藏。对于需要长期保存的菌种，可以采用______________ 的方法。