1 . PHB2蛋白是一种动物肝脏合成具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为0.9kb（1kb=1000碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：
(1)为获取phb2基因，提取该动物_____内的RNA，再经_____过程得到cDNA，将其作为PCR反应的模板，并设计_____来扩增目的基因。PCR扩增过程为_____三个步骤。
(2)图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2基因（该基因序列不含图1中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入_____和_____两种不同限制酶的识别序列。选择这两种限制酶的理由是_____。

   

相关限制酶的识别序列及切割位点

名称	识别序列及切割位点	名称	识别序列及切割位点
HindⅢ	A↓AGCTT TTCGA↑A	EcoRI	G↓AATTC CTTAA↑G
PvitⅡ	CAG↓CTG GTC↑GAC	PstI	CTGC↓AG GA↑CGTC
KpnI	G↓GTACC CCATG↑G	BamHI	G↓GATCC CCTAG↑G

注：箭头表示切割位点
(3)转化前需用_____处理大肠杆菌细胞，使其处于吸收环境中DNA的生理状态，以提高转化效率。
(4)将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经_____方法分离，结果如图2，_____号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。

   

注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0．2kb的DNA分子条带未出现在图中

2 . 为研究耐旱基因（LEA）对甘蓝型油菜油脂的积累机制，科研人员构建了LEA基因与荧光素酶基因（Luc）表达载体，相关碱基序列及酶切位点如图所示。回答下列问题：

   

(1)由图可知，不能选择BamHI酶进行切割载体的理由是______________最好选择两种限制酶而不是一种限制酶进行酶切的理由是____________。
(2)利用PCR扩增LEA基因时，需要在LEA基因左右两端分别添加相应的限制酶EcoRV和XbaI识别序列，需要在引物的__________（填“3'端”或“5'端”）添加限制酶识别序列。一个LEA基因连续扩增4次，共需要__________个引物，依据图中已知碱基序列，在PCR扩增仪中加入的引物的碱基序列为__________（填下列序号）。

①5'-GATATCATGGGC-3'                           ②5'-TCTAGAATGGGC-3'

③5'-TCTAGACTAGTG-3'                           ④5'-GATATCCTAGTG-3'

(3)常用农杆菌转化法将目的基因导入油菜受体细胞，依据农杆菌的侵染特点，目的基因将插入到Ti质粒的__________上，经过转化作用，进入油菜细胞，并将其插入到__________，从而使其得以维持稳定和表达。

3 . 将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育耐盐碱海水稻新品种。下图PCR扩增OsMYB56时需要添加引物，应选用的引物组合为（       ）

   

A．5'-CTTCGATGAT-3'和5'-TCTGTTGAAT-3'

B．5'-CTTGGATGAT-3'和5'-TAAGTTGTCT-3'

C．5'-ATTCAACAGA-3'和5'-ATCATCCAAG-3'

D．5'-ATTCAACAGA-3'和5'-GAACCTACTA-3

4 . 研究发现，人溶菌酶（hLZ）是天然抗生素替代品。科学家培育出转入溶菌酶基因山羊，以大规模生产人溶菌酶（从乳汁中提取），过程如图所示，其中编号①～⑨表示过程。请回答下列问题：

   

(1)图中转基因山羊生产人溶菌酶运用了______________等（至少填3项）现代生物工程技术。
(2)过程①使用PCR技术在体外扩增hLZ基因，扩增时需要_______种引物。过程③形成重组质粒需要的限制酶是______________。
(3)将重组质粒转入山羊成纤维细胞后，筛选出含重组质粒的山羊胎儿成纤维细胞，用到的质粒S中标记基因为__________。⑥过程未受精的卵母细胞去核过程中，去除的“核”实际上是______________。
(4)过程⑧体外培养得到早期胚胎，应在_______时期进行胚胎的移植。此外，移植前要进行性别鉴定和遗传病筛选等，要从胚胎的_______细胞取样。为检测过程⑨得到的转基因山羊是否成功，最简单的方法是__________。

5 . 环境DNA（eDNA——环境中的总DNA）技术在鱼类生态学中应用的基本方法是：从目标水体环境（如池塘）中获得eDNA，对鱼类科、属、种等的特定核酸序列扩增、定量和测序。应用该技术理论上不易实现的是（     ）

A．外来物种入侵的监测	B．种群年龄结构的建立
C．两个种群密度的比较	D．两个物种生物量的比较

6 . 油菜素内酯被认为是第六类植物激素，广泛分布于植物体内，其能促进细胞生长、细胞分裂和农药在植物体内的降解和代谢。用油菜素内酯处理后，许多参与农药降解的基因（如 P450基因和红霉素抗性基因）的表达和酶活性都得到了提高，在这些基因指导下合成的蛋白酶能把农药逐渐转化为水溶性物质或低毒甚至无毒物质，有的则被直接排出体外。根据以上信息，研究人员进行了如下实验操作，请回答下列问题：

(1)用 PCR扩增获取目的基因，首先要制备2种引物，为_______提供结合位点，并从引物______端（填“5”或“3”）开始拼接单个的脱氧核苷酸。
(2)在构建重组质粒1时，最好用两种不同的限制酶进行切割，这样可以有效防止酶切产物_______。将构建的重组质粒2与用_______处理的受体细菌混合，从而将目的基因导入受体细菌，且在受体细菌内________该过程称为转化。
(3)培养菌落的实验过程中，应向培养基中加入_______可将含有目的基因的细菌筛选出来，图中将受体细菌的菌液接种到培养基上的方法是_____。

7 . 研究人员利用转基因技术改造乳酸杆菌，将其添加于饲料中，以提高家禽养殖效率。枯草芽孢杆菌能分泌一种可降解纤维素的酶，这种酶由W基因编码。为在乳酸杆菌中表达W基因，需使用图1中质粒为载体，图2为含W基因的DNA片段。
   
(1)采用_____________技术可以快速、大量获得W基因。利用该技术扩增目的基因时，需要____________等作为原料和直接能源物质。
(2)启动子是____________识别和结合的部位。很多启动子具有物种特异性，在图1质粒中插入W基因，其上游启动子应选择____________（填写字母）。
A．枯草芽孢杆菌启动子     B．乳酸杆菌启子   C．农杆菌启动子
(3)根据图1和图2，应使用限制酶____________切割图2中含W基因的DNA片段，导入质粒以获得能正确表达W基因的重组质粒。所得重组质粒转化乳酸杆菌后，使用含_____________的培养基筛选，以得到转入W基因的乳酸杆菌。
(4)目的基因导入受体细胞后，常用_________技术检测目的基因是否翻译出降解纤维素的酶。
(5)为确定导入重组质粒的乳酸杆菌是否具有分解纤维素的能力，研究人员用液体培养基分别培养下表所示菌种。取部分菌液上清液测定酶活力，实验方案及测定结果如下表所示。表中的X应为____________。

菌种	酶活性相对值
乳酸杆菌	未检出
X	未检出
导入了重组质粒的乳酸杆菌	0.96

8 . 抗菌肽通常是由短氨基酸序列构成的小肽，具有广谱的杀菌活性，利用基因工程生产抗菌肽的难题之一是大肠杆菌能识别外源蛋白并将其水解。某科研小组将抗菌肽基因与大肠杆菌自身的半乳糖苷酶基因连接，组成融合基因，通过质粒构建基因表达载体并导入大肠杆菌中，以获得大量的抗菌肽。如图1、图2为融合基因和该实验所用质粒的结构示意图。请回答下列问题：

注：EcoRⅠ、SmaⅠ、BamHⅠ、HindⅢ为不同的限制酶，Amp ⁸为氨苄青霉素抗性基因，Tetⁿ为四环素抗性基因。
(1)分析图1可知，利用PCR技术扩增融合基因时，应选择的引物是___________，这样选择的理由是___________（答出2点）。
(2)为构建重组质粒并保证基因能定向插入质粒中，需选择限制酶 ___________切割质粒和含融合基因的 DNA 片段。筛选重组质粒时，应将大肠杆菌分别接种到含氨苄青霉素和四环素的培养基上，若___________，则说明重组质粒成功导入大肠杆菌细胞内。上述培养基可为大肠杆菌的生长繁殖提供的营养物质有___________
(3)该实验利用大肠杆菌获得抗菌肽时，将抗菌肽基因和大肠杆菌自身的半乳糖苷酶基因组成融合基因的目的是___________。

9 . 人血清白蛋白(HSA)具有重要的医用价值，只能从人血浆中制备。下图是以基因工程技术获取重组HSA(rHSA)的两条途径。

(1)为获取HSA基因，首先需采集人的血液，提取________合成总cDNA，然后以cDNA为模板，使用PCR技术扩增HSA基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。
______
(2)启动子通常具有物种及组织特异性，构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体，需要选择的启动子是________(填写字母，单选)。

A．人血细胞启动子

B．水稻胚乳细胞启动子

C．大肠杆菌启动子

D．农杆菌启动子

(3)构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA载体的过程中，用到的工具酶有限制酶和__________，其作用于__________键。
(4)人体合成的初始HSA多肽，需要经过膜系统加工形成正确空间结构才有活性。与途径Ⅱ相比，选择途径Ⅰ获取rHSA的优势是______________。
(5)为证明rHSA具有医用价值，须确认rHSA与___________的生物学功能一致。

10 . 下列有关生物实验过程的叙述，错误的是（　　）

A．在凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA分子结合，便于在紫外灯下观察

B．苏丹Ⅲ染液鉴定花生子叶中脂肪颗粒时，若染色时间过长可能观察不到脂肪颗粒

C．检测酵母菌呼吸产物时，加入酸性重铬酸钾溶液后变为灰绿色，不能说明一定有酒精产生

D．加入双缩脲试剂出现紫色反应的待测液中不一定含有蛋白质