2 . 下图是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（tet^r）和氨苄青霉素抗性基因（amp^r）。请回答下列问题：

（1）EcoRV酶切出的线性载体P1的末端为，属于______________末端，由此可判断EcoRV酶识别的碱基序列为______________。
（2）利用PCR技术扩增目的基因片段的前提是______________。在PCR扩增仪中设定目的基因片段n次复制的时间，需加入______________种引物。有人认为下面的表达式不能反映Taq酶的功能，这是因为________________________________________________________。

（3）为筛选出含重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表（“+”代表生长，“-”代表不生长）。

菌落类型 平板类型	A	B	C
无抗生素	+	+	+
氨苄青霉素	+	+	-
四环素	+	-	-
氨苄青霉素+四环素	+	-	-

根据表中结果判断，应选择的菌落是______________（填表中字母）类，另外两类菌落质粒导入情况分别是______________、______________。

3 . 噬菌体展示技术是将外源目标基因插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使目标蛋白被展示到噬菌体表面的生物技术（下图所示）。被展示的蛋白质可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。请分析回答：

(1)插入载体之前，目标基因一般需经PCR扩增。PCR扩增基因的原理是____________。若目标基因的核苷酸序列未知，但已知其临近区域的上、下游的部分序列如下所示，请从表中所列引物中选出一对合适的引物用于目标基因的PCR扩增：____________。
5′—GACGCATTACGGTAAC••••••TCCAGCTTAGCAGTAA—3′
3′—CTGCGTAATGCCATTG••••••AGGTCGAATCGTCATT—5′

引物Ⅰ		引物Ⅱ
甲	5′—CTGCGTAATGCCATTG	A	5′—AGGTCGAATCGTCATT
乙	5′—GACGCATTACGGTAAC	B	5′—TCCAGCTTAGCAGTAA
丙	5′—GTTACCGTAATGCGTC	C	5′—TTACTGCTAAGCTGGA
丁	5′—CAATGGCATTACGCAG	D	5′—AATGACGATTCGACCT

(2)目标基因能够与噬菌体外壳蛋白结构基因拼接成功，其结构基础是____________；建立噬菌体展示库需用的工具酶有____________。
(3)目标蛋白的筛选利用了____________方法，其原理是____________。
(4)扩大培养时，进行诱变处理的目的可能是通过提高某些基因的突变率而获取____________；根据噬菌体的特征，扩大培养体系中必须含有____________，噬菌体才能繁殖。多次筛选后，____________ 的噬菌体得到高度富集。

4 . 科学家首次运用基因工程的手段，导入优质纤维高产基因 KCS，可提高我国棉花 的产量和品质。经过十多年艰苦实验、不断培育，将我国棉花纤维的长度提高了 0．3 厘米， 如今新疆棉花品质位居世界前列。如图 1 表示含有目的基因 KCS 的 DNA 片段长度(bp 即碱基对)和部分碱基序列，图 2 表 示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有 MspI、BamHI、MboI、SmaI 4 种限制性内切核酸 酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为 C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。据图 回答下列问题：

Ⅰ（1）培育转基因棉花需要用到的工具有_____________________。
（2）若用限制酶 SmaI 完全切割图中含有目的基因 D 的 DNA 片段，其产物长度分别为___________。
（3）基因工程中使用的目的基因主要是指____________________ 。重组质粒中除目 的基因外，还必须有_____________________。
（4）若将图 2 中质粒和目的基因 D 通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应 选用的限制酶是_______ 。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因 D 不能正 确表达，其最有可能的原因是____________________ 。
（5）导入目的基因的植物细胞，经过植物组织培养技术得到幼苗，该技术利用的原理是______。
Ⅱ 为了提高转基因的成功率，需要通过 PCR 技术扩增目的基因，以获得目的基因的大量拷贝。
（6）在目的基因进行扩增时，加入的引物有 A、B 两种，引物的作用是_____， 若该目的基因扩增 n 代，则其中含有 A、B 引物的 DNA 分子有____个。
（7）PCR 过程中退火(复性)温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。如表为根据模板 设计的两对引物序列,如图为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高的退 火温度:_______________。理由是___________________________________ 。
引物对序列表

引物对 A	P1 AACTGAAATGTAGCTATC P2 TTAAGTCCATTACTCTAC
引物对 B	S1 GTCCGACTAGTGGCTGTG S2 AGCTGGCGTTTAGCCTCG

5 . 哺乳动物体内一定含量的w—3多不饱和脂肪酸（LCPUFA）可以起到预防心血管疾病的作用，但LCPUFA在大多数动物体内不能合成，只能从食物中摄取。科研人员从秀丽隐杆线虫中获得LCPUFA合成酶基因fat—1（1229bp），培育转fat-1基因家兔，其部分流程如图一所示。

(1)PCR扩增fat-1基因的前提是____，以用于特异性制备PCR扩增需要的引物。PCR扩增过程中，经过5轮循环后，得到的产物中只含一种引物的DNA分子占比为____。
(2)在构建PEBf质粒时，为确保fat-1基因按正确方向插入，需要双酶切，还需对fat-1基因的引物进行相应设计。已知fat-1基因转录的模板链为a链，与b链结合的引物5端添加了限制酶识别序列GAATTC，则另一引物5’端需添加的限制酶识别序列为____，理由是____。
(3)转染是将外源分子如DNA、RNA等导入真核细胞的技术。为了检验图一家兔成纤维细胞是否转染成功，科研人员分别提取培养液中各细胞的DNA，利用fat-1基因引物进行PCR扩增后电泳，部分结果如图二所示。据图分析，1组和2组分别是____细胞组PCR产物。
(4)检测转基因家兔细胞中是否含有LCPUFA合成酶，可采用____技术。如果fat-1基因已正确插入PEB质粒且成功转染，但在转基因家兔细胞中没有检测到LCPUFA合成酶，从构建基因表达载体的角度分析，可能的原因是____。

6 . 哺乳动物体内一定含量的w—3多不饱和脂肪酸（LCPUFA）可以起到预防心血管疾病的作用，但LCPUFA在大多数动物体内不能合成，只能从食物中摄取。科研人员从秀丽隐杆线虫中获得LCPUFA合成酶基因fat-1（1229bp），培育转fat—1基因家兔，其部分流程如图一所示。

(1)质粒上复制原点序列为复制的起始区域，该区域的序列容易解旋成单链，据此推测该区域中___碱基所占的比例较高，启动子的作用是___。
(2)在构建PEBf质粒时，为确保fat—1基因按正确方向插入，需要双酶切，还需对fat—1基因的引物进行相应设计。已知fat—1基因转录的模板链为a链，与b链结合的引物5’端添加了限制酶识别序列GAATTC，则另一引物5’端需添加的限制酶识别序列为___，理由是___。
(3)转染是将外源分子如DNA、RNA等导入真核细胞的技术。为了检验图一家兔成纤维细胞是否转染成功，科研人员分别提取培养液中各细胞的DNA，利用fat—1基因引物进行PCR扩增后电泳，部分结果如图二所示。据图分析，1组和2组分别是___细胞组PCR产物。
(4)检测转基因家兔细胞中是否含有LCPUFA合成酶，可采用___技术。如果fat—1基因已正确插入PEB质粒且成功转染，但在转基因家兔细胞中没有检测到LCPUFA合成酶，从基因表达载体结构的角度分析，可能的原因是___。

7 . PCR技术是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，其最大的特点是能将微量的DNA大幅增加。
I.如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图1（以EcoRI酶切为例）所示。
(1)步骤Ⅱ中所用的DNA连接酶的作用是催化形成____________，从而形成环状DNA。
(2)步骤Ⅲ中的复性温度设定是成败的关键，温度过高会破坏______________________的碱基配对。

(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是__________（填数字“①、②、③、④”）。

	DNA序列（虚线处省略了部分核苷酸序列）
已知序列
PCR引物	①5′-AACTATGCGCTCATGA-3′   ②5′-AGAGGCTACGCATTGC-3′ ③5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′   ④5′-TCATGAGCGCATAGTT-3′

(4)新冠病毒核酸定性检测原理：先以病毒RNA为模板利用__________酶合成cDNA，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段，然后在扩增产物中加入特异的核酸探针。如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。此方法为RT-PCR技术。
(5)如果探针是带有荧光标记的，即为“实时荧光RT-PCR技术”。在PCR反应体系中，加入的荧光探针与模板DNA的某条链互补结合，探针完整时，报告荧光基团发射的荧光信号被淬灭荧光基团吸收。当子链延伸至探针处，探针被TaqDNA聚合酶降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而发出荧光（如图2所示）。即每扩增1个DNA分子，就有1个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

①若最初该反应体系中只有1个DNA分子模板，进行第4次循环时，需要消耗荧光探针____________个。
②检测时，荧光强度一般要达到或超过阈值才能确诊。若检测出现假阴性，推测可能的一个原因__________________________________。

9 . 酵母菌絮凝是指菌体细胞间通过细胞壁相互粘附、聚集成团的现象。适当提高酵母的絮凝能力，有助于发酵后细胞和产物的分离，节约生产成本。科研人员为研究R基因对酵母菌絮凝性能的影响，用基因工程技术获得了R基因被敲除的酵母菌菌株，主要步骤如图1（G418为一种氨基糖苷类抗生素）。据图回答：

   

(1)过程①，引物2和引物4分别添加了MluⅠ的识别序列，则引物1和引物3的5'端分别添加_____的识别序列，PCR获取R基因左右两端的N和C片段过程中，除图中条件外，还需提供_____等条件（至少写三个）。
(2)利用含_____的培养基筛选出重组酵母，再挑取单菌落进行PCR扩增，验证酵母细胞R基因是否被敲除，则扩增时选择引物组合是_____。
(3)科研人员继续将野生酵母菌和R基因敲除酵母菌的菌液接种到装有麦芽汁的锥形瓶中，一定条件下静置发酵7天，测定酒精发酵能力和絮凝能力，结果如下表。

指标种类	酒精发酵能力	絮凝能力
野生酵母菌	4．5%	63．1%
R基因敲除酵母菌	4．5%	83．1%

①酒精发酵期间，每个锥形瓶应注意保持_____条件和定期排气。
②实验结果表明，R基因敲除酵母菌是否符合生产需求？请说出你的判断依据。_____。
(4)科研人员又将不同浓度梯度的R基因敲除酵母菌菌液和野生酵母菌菌液点样于含30g/mL钙荧光白（细胞壁抑制剂，破坏细胞壁的正常组装）的YPD培养基上，结果如图2．推测R基因敲除酵母菌絮凝能力变化的原因是_____。

   

10 . 盐芥是十字花科盐芥属植物，因生长于农田区的盐渍化土壤而得名。为研究盐芥iTS基因在植物逆境胁迫应答中的重要作用，科研人员做了一系列研究。
(1)取待测盐芥组织裂解破碎，进行DNA提取和纯化，得到待测盐芥基因组DNA。该过程常用的试剂有EDTA、SDS、NaCl、酒精等。在研磨液中加入NaCl的目的是_____________；纯化DNA时可使用酒精，是因为_____________________________。
(2)为了特异性扩增iTS基因序列，需根据_____________设计特异性引物。在反应体系中加入相应物质和原料后，将PCR仪的温度设定为：变性94℃（30s）、复性58℃（30s）、延伸72℃（40s）。“延伸”的温度设定为72℃，是因为该温度下_____________。若iTS基因的数量为a个，上游引物数∶下游引物数=1∶50，该体系扩增进行5轮循环后，上游引物刚好耗尽，则上游引物的数量等于_____________条。
(3)用限制酶M切割某DNA分子，过程如图1所示，其中虚线部分为盐芥iTS基因。

图1中的DNA分子上限制酶M的切割位点有_____________个，它能够特异性识别的序列是_____________，下图2中能与iTS基因进行重组的Ti质粒是_____________。（所示碱基序列为不同载体中方框内的序列）

(4)将获得的重组质粒通过____________法导入大豆愈伤组织中，最终获得转基因大豆植株，iTS基因能否在大豆植株体内维持和表达其遗传特性的关键是____________。
(5)为验证iTS基因能提高大豆的耐盐性，研究人员进行了以下实验，结果如下表所示。

大豆类型	处理方式	叶片中叶绿素含量	根部细胞渗透压
野生型大豆	0.15mol/L的NaCl溶液处理	低	低
转iTS基因大豆		高	高

综合上述研究，iTS基因能提高植物耐盐性的机理是_______________________________。