1 . 为使水稻获得抗除草剂性状，科研人员将除草剂草甘膦抗性基因转入水稻植株，获得抗草甘膦转基因水稻。回答下列问题：

(1)将草甘膦抗性基因作为目的基因，与Ti质粒构建基因表达载体。目的基因表达载体进入细胞后，Ti质粒上的___区段可转移到油菜细胞的基因组中。为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用2种限制酶，选择的原则是___。
①Ti质粒内，每种限制酶只有一个切割位点
②酶切后，Ti质粒形成的两个黏性末端序列相同
③酶切后，草甘膦抗性基因形成的两个黏性末端序列不相同
④草甘膦抗性基因编码蛋白质的序列中，每种限制酶只有一个切割位点
A.①③   B.①④   C.②③   D.②④
(2)农杆菌经处理后，将其与基因表达载体混合，完成___后，在添加___的培养基中，经筛选1得到含目的基因表达载体的农杆菌。
(3)利用PCR技术，可以鉴定被侵染的愈伤组织中是否含有草甘膦抗性基因。草甘膦抗性基因一条链的两端序列如下：

根据上述序列应选择引物___（填序号）进行PCR。若进行30轮循环，需引物___个。
①引物:5’-TCTGTTGAAT-3’
②引物:5’-GAACCTACTA-3’
③引物:5’-ATTCAACAGA-3’
④引物:5’-CTTGGATGAT-3’
(4)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如下图所示）。在PCR反应体系中含有耐高温的DNA聚合酶，右面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为___。

(5)除了鉴定愈伤组织中是否含有目的基因以外，还可以利用___方法来鉴定草甘膦抗性基因的表达产物，从而进行图中的筛选2，两次筛选后得到的转基因愈伤组织经过细胞的___过程，获得转基因水稻。

2 . 水稻根部一般没有根瘤菌，在种植时常需要施加氮肥。科学家想利用基因工程技术将相关基因导入水稻细胞中，建立水稻“小型化肥厂”，让水稻直接固氮，减少使用氮肥的生产成本以及可能造成的环境污染。下列相关叙述错误的是（       ）

A．PCR技术可用于固氮基因的获取和检测

B．利用PCR技术扩增固氮基因时，无需加入解旋酶

C．实验中需将转基因水稻种植在缺氮培养液中进行筛选

D．为了提高PCR扩增固氮基因的特异性，可适当增加引物长度并降低复性温度

3 . 水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建基因表达载体，再利用农杆菌转化法进一步转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因（Wx基因）启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，研究人员检测了胚乳细胞中Wx基因转录产生的mRNA（WxmRNA）的量，结果如图所示。下列说法正确的是（       ）

A．构建基因表达载体时需要限制酶切割Ti质粒的磷酸二酯键和氢键

B．与野生型水稻相比，3个突变品系中的直链淀粉合成酶的氨基酸序列发生了改变

C．根据各品系WxmRNA量的检测结果，可推测品系3的糯性最强

D．用PCR等技术检测是否表达出WxmRNA的过程中存在碱基U与A互补配对

4 . 大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中。利用上述原理可初步获得质粒DNA，分别用限制酶1和限制酶2对提取的质粒DNA完全切割后进行扩增产物的琼脂糖凝胶电泳，结果如图所示（注：KB表示千碱基对数，M代表标准对照）。下列说法正确的是（       ）

   

A．在提取白色丝状物时双向搅拌比单向搅拌更有利于获得结构完整的DNA

B．将提取的DNA溶于2mol/LNaCl溶液后，加入二苯胺试剂即可呈现蓝色

C．若同时用限制酶1和限制酶2切割该DNA，电泳结果至少呈现2个条带

D．用琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒，被染色的质粒不需要通过紫光灯照射就能看到结果

5 . 科学家为了提高干扰素的抗病毒活性和储存稳定性，采用重叠延伸PCR技术，将干扰素基因中相应位点的C//G碱基对特定突变为G//C碱基对，从而使干扰素中的第17位氨基酸由半胱氨酸变成丝氨酸。该技术采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来，获得定点突变的干扰素基因，然后导入大肠杆菌生产表达新的干扰素，原理如下图。回答下列问题：

(1)利用重叠延伸PCR技术诱变干扰素基因时，将预期的突变碱基设计在PCR的引物3和引物4中，制备出“PCR体系1”和“PCR体系2”，分别进行PCR扩增。“PCR体系2”中加入的引物是____________。得到图中由c、d链构成的完整DNA分子至少需要“PCR体系2”进行___________次循环。
(2)将PCR体系1、2的产物（图中ab和cd）混合后，继续进行下一次PCR反应。在该PCR反应体系中经过高温变性后，当温度下降到55℃，能够互补配对的DNA链相互结合，理论上有__________种结合的可能，其中能进行进一步延伸的有___________种。
(3)为便于构建基因表达载体，需要将限制酶EcoRI和SalI的识别序列分别引入诱变干扰素基因的两端，操作思路是_____________。
(4)利用重叠延伸PCR技术还可以将两个不同来源的DNA片段拼接起来。有人想利用该技术把基因M和N拼接在一起，设计基因M的引物M₁、M_2，基因N的引物N₁、N₂。在设计这4种引物时，特别要注意的问题是_______________。

6 . 下图为利用PCR技术扩增特定DNA片段的部分示意图，图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列有关描述错误的是（       ）

A．利用PCR技术扩增目的基因时不需要解旋酶而需要耐高温的DNA聚合酶

B．引物是子链合成延伸的基础，子链沿着模板链的5'→3'方向延伸

C．从理论上推测，第四轮循环产物中只含有引物A的DNA片段所占的比例为15/16

D．在第三轮循环产物中才开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段且占1/2

7 . 以下为形成cDNA过程和PCR扩增过程示意图。据图分析，下列说法正确的是（       ）

A．催化①过程的酶是RNA聚合酶

B．催化②⑤过程的酶都是DNA聚合酶，都能耐高温

C．③过程不需要解旋酶的作用

D．通过cDNA过程和PCR过程获得的同一目的基因的结构完全相同

8 . 聚合酶链式反应（PCR）能实现对相应核苷酸序列的大量复制，相关叙述正确的是（       ）

A．为激活相应酶，PCR反应缓冲液中需加入Mg2+

B．复性是为了使解旋后的两条链恢复双螺旋结构

C．PCR的产物通常用抗原—抗体杂交技术进行鉴定

D．该技术需要用到引物、脱氧核苷酸、解旋酶等

9 . 基因检测是指通过检测生物体中的DNA序列，以了解生物体基因状况的技术手段。Sanger双脱氧链终止法是DNA测序的基本方法，其原理是：核酸模板在核酸聚合酶、带有3′﹣OH末端的单链核苷酸引物、四种dNTP存在的条件下复制或转录时，如果在反应系统中分别引入单一种类的ddNTP（即2、3双脱氧核苷三磷酸，在脱氧核糖的3′位置缺少一个羟基），只要ddNTP掺入链端，该链就停止延长，链端掺入dNTP的片段可继续延长。通过电泳将各种片段分开，根据末端核苷酸可得到原始序列信息。具体流程图如图1。

   

(1)图中设计引物的原因是____，若待测核酸模板为RNA，则需要在____酶的帮助下合成DNA单链片段。
(2)ddNTP为2，3﹣双脱氧核苷三磷酸，只要ddNTP掺入链端，该链就停止延长的原因是____。
(3)假设某反应体系中，待测DNA单链序列3′-GTACAGTA-5′，加入4种dNTP和ddTTP，经过双脱氧链终止法处理，会得到____种片段，其中最短的片段序列是____。
(4)鉴定产物片段通常用琼脂糖凝胶电泳，DNA分子在凝胶中的迁移速率与____有关。假设某次Sanger双脱氧链终止法测序得到的电泳图如图2所示，则待测DNA序列从5′端到3′端为____。

10 . 酵母菌絮凝是指菌体细胞间通过细胞壁相互粘附、聚集成团的现象。适当提高酵母絮凝能力，有助于发酵结束时细胞和产物的分离，大幅节约生产成本。科学家研究了R基因对絮凝能力的影响。
(1)葡萄酒生产中，产生酒精的反应式是____，而酒的颜色主要来自于葡萄皮细胞____（填细胞器的名称）中的花青素。
(2)科研人员利用基因工程技术获得R基因被敲除的酵母菌菌株。
①构建含有卡那霉素抗性基因的重组质粒，用LiCl处理酵母菌，使其处于____生理状态，以实现重组质粒的导入。质粒上的卡那霉素抗性基因通过重组，替换酵母菌的R基因。
②利用含有卡那霉素的培养基获得单菌落。挑取单菌落，利用PCR技术进行扩增，以确定酵母细胞的R基因是否被成功敲除。若单菌落扩增后的DNA样品电泳结果如下图1，则下图2中对应泳道1和泳道2的引物组合分别为____。（填序号）

(3)科研人员对野生菌株和R基因敲除菌株的酒精发酵能力和絮凝能力进行了测定，结果如表。

	酒精发酵能力	絮凝能力
野生菌株	4.5%	63.06%
R基因敲除菌株	4.5%	83.12%

实验结果表明，获得的R基因敲除菌株符合生产需求，依据是____。
(4)科研人员进一步研究R基因影响絮凝能力的作用机制。
①将R基因敲除菌株和野生菌株分别用无菌水进行梯度稀释。将不同浓度梯度的酵母菌液点样于含30μg/mL钙荧光白（细胞壁组装抑制剂）的YPD平板培养基上，培养适当时间后结果如下图3。

图3

②综合上述实验结果，推测R基因敲除菌株絮凝能力变化的原因是____。