2 . 胡萝卜抗冻蛋白基因（afp）是人类发现的第一个植物抗冻蛋白基因，对于植物抗冻基因工程具有非常重要的意义。下表为几种限制酶的识别序列及酶切位点，下图表示构建afp基因表达载体的过程，其中PUCm-T、PBI121为人工改造后的质粒，LacZ基因可用于重组质粒的筛选。

限制酶	识别序列
BamH I	5'-G↓GATCC- 3'
EcoR I	5'-G↓AATTC- 3'
Pst I	5'-C↓TGCAG- 3'
Xba I	5'-T↓CTAGA- 3'
Sma I	5'- CCC↓ GGG- 3'

(1)通过PCR获得afp时，需选用的引物为__________，至少经过_________次循环即可获得afp。
(2)PCR产物往往在引物端含有多个A聚合的尾，而PUCm-T尾端由多个T聚合，所以在构建克隆载体时不需要用限制酶处理afp和PUCm-T，理由是__________。
(3)LacZ基因编码的β-半乳糖苷酶可催化乳糖的水解，培养基中添加物质IPTG可诱导LacZ基因的表达，将培养基中的白色物质X-gal转化为蓝色物质。据图分析，成功导入克隆载体的大肠杆菌菌落呈___________（填“白色”或“蓝色”），理由是__________。
(4)提取大肠杆菌中的克隆载体后，先用EcoRI处理克隆载体，再将两端形成的黏性末端补平，补平后再用XbaI处理，得到了一端平末端，一端黏性末端的afp，同时选用_________（从表中选择）处理PBI121质粒，然后用DNA连接酶将PBI121与alp进行连接，构成afp基因表达载体。在此过程中，使afp的两端形成不同的末端的意义是_________。

3 . TaqMan荧光探针是一小段被设计成可以与靶DNA序列中间部位特异结合的单链DNA，该单链DNA的5'和3'端带有短波长和长波长两个不同荧光基团。这两个荧光基团由于距离过近，会发生荧光淬灭，检测不到荧光。PCR反应中，TaqMan探针会结合到与之配对的靶DNA序列上，随后被具有外切酶活性的TaqDNA聚合酶降解，从而解除荧光淬灭的束缚，发出荧光，其机理如下图。下列叙述正确的是（       ）

A．TaqMan探针的碱基序列越长，与靶DNA序列结合的特异性越强

B．设计引物1和引物2时，应避免二者的碱基序列存在互补序列

C．TaqDNA聚合酶具有外切酶活性，说明TaqDNA聚合酶无专一性

D．PCR反应液荧光强度的高低与PCR循环次数呈正相关

4 . 大肠杆菌pSC101质粒中含有四环素抗性基因，金黄色葡萄球菌p1258质粒中含有氨苄青霉素抗性基因。用限制酶EcoRI分别处理pSC101和p1258，产物经琼脂糖凝胶电泳后分别得到1个和4个条带。将酶切产物混合后用DNA连接酶处理，然后转化到大肠杆菌中。下列叙述错误的是（       ）

A．pSC101中至少含有1个EcoRI识别位点，p1258中至少含有4个EcoRI识别位点

B．进行琼脂糖凝胶电泳时，分子大小相同的DNA片段所形成的条带可能会重叠在一起

C．DNA连接酶处理酶切产物后，若仅考虑两种不同DNA片段连接，可得到10种不同序列的DNA片段

D．能在含有四环素和氨苄青霉素的培养基中存活的大肠杆菌含有p1258的部分基因