1 . 为使水稻获得抗除草剂性状，科研人员将除草剂草甘膦抗性基因转入水稻植株，获得抗草甘膦转基因水稻。回答下列问题：

(1)将草甘膦抗性基因作为目的基因，与Ti质粒构建基因表达载体。目的基因表达载体进入细胞后，Ti质粒上的___区段可转移到油菜细胞的基因组中。为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用2种限制酶，选择的原则是___。
①Ti质粒内，每种限制酶只有一个切割位点
②酶切后，Ti质粒形成的两个黏性末端序列相同
③酶切后，草甘膦抗性基因形成的两个黏性末端序列不相同
④草甘膦抗性基因编码蛋白质的序列中，每种限制酶只有一个切割位点
A.①③   B.①④   C.②③   D.②④
(2)农杆菌经处理后，将其与基因表达载体混合，完成___后，在添加___的培养基中，经筛选1得到含目的基因表达载体的农杆菌。
(3)利用PCR技术，可以鉴定被侵染的愈伤组织中是否含有草甘膦抗性基因。草甘膦抗性基因一条链的两端序列如下：

根据上述序列应选择引物___（填序号）进行PCR。若进行30轮循环，需引物___个。
①引物:5’-TCTGTTGAAT-3’
②引物:5’-GAACCTACTA-3’
③引物:5’-ATTCAACAGA-3’
④引物:5’-CTTGGATGAT-3’
(4)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如下图所示）。在PCR反应体系中含有耐高温的DNA聚合酶，右面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为___。

(5)除了鉴定愈伤组织中是否含有目的基因以外，还可以利用___方法来鉴定草甘膦抗性基因的表达产物，从而进行图中的筛选2，两次筛选后得到的转基因愈伤组织经过细胞的___过程，获得转基因水稻。

2 . 水稻根部一般没有根瘤菌，在种植时常需要施加氮肥。科学家想利用基因工程技术将相关基因导入水稻细胞中，建立水稻“小型化肥厂”，让水稻直接固氮，减少使用氮肥的生产成本以及可能造成的环境污染。下列相关叙述错误的是（       ）

A．PCR技术可用于固氮基因的获取和检测

B．利用PCR技术扩增固氮基因时，无需加入解旋酶

C．实验中需将转基因水稻种植在缺氮培养液中进行筛选

D．为了提高PCR扩增固氮基因的特异性，可适当增加引物长度并降低复性温度

3 . 下列关于PCR过程及结果的叙述正确的是（　　）

A．若在酶和引物都正常工作，但是不出现扩增带，其原因可能是核酸模板变性不彻底导致的

B．复性的温度设定与引物有关，延伸时间的设定与扩增片段的长度有关

C．PCR与细胞内DNA复制破坏氢键的原理相同

D．理论上推测，第n轮循环产物中只含有一种引物的DNA片段所占比例为1/2n-1

4 . 基因定点突变的目的是通过定向地改变基因内一个或少数几个碱基来改变多肽链上一个或几个氨基酸。该技术是蛋白质工程的重要技术。下图为利用PCR技术进行定点突变的流程，相关叙述错误的是（       ）

A．由于基因决定蛋白质，因此要对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过改造或合成基因来完成

B．酶① 应为耐高温DNA聚合酶，引物X和Y应该为引物2和4

C．可以将引物1、引物2、引物3和引物4置于同一个反应系统中同时进行第一个阶段的反应，进而缩短实验时间

D．利用图示流程技术可以将两个不同的基因拼接到一起

5 . 实时荧光 RT-PCR用于RNA病毒的核酸检测，其原理是：在PCR性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光，如图所示。下列有关叙述正确的有（　　）

A．与细胞内DNA 制相比，该技术用的DNA聚合酶最适温度较高

B．通过温度变化的控制为变性、复性和延伸等过程提供能量

C．该过程中消耗引物的量与发出的荧光强度之间呈负相关

D．与抗体检测相比，核酸检测能更早发现患者并及时治疗

6 . PCR技术在生物工程中应用广泛，PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，下列有关叙述错误的是（       ）

A．PCR及电泳过程中用到了多种缓冲液，PCR反应的缓冲液中一般要添加Mg2+用于激活DNA聚合酶，凝胶载样缓冲液中的DNA可用紫外灯进行检测

B．用于构建基因表达载体的质粒用限制酶切割前后长度可能不发生变化，但可通过电泳检测质粒是否被切开

C．PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在复性过程起作用

D．采用PCR技术对一个DNA进行扩增，第n次循环共需要引物2n个

7 . 亚洲棉的突变型光籽和野生型毛籽是-对相对性状，研究发现，亚洲棉某突变体的光籽表型与8号染色体的~880kb至~903kb区间相关，研究人员根据野生型毛籽棉的该区间设计连续的重叠引物进行PCR，产物扩增结果如图所示，下列说法正确的是（       ）

A．应提取该突变体和野生型亚洲棉的全部染色体DNA进行PCR

B．上图中PCR产物的鉴定是通过琼脂糖凝胶电泳来进行的

C．据图分析可知，分子量较大的扩增产物与点样处的距离较小

D．该突变体出现的根本原因是第6对引物对应区间发生了基因突变

8 . 环境DNA（eDNA）技术是指从环境中提取DNA片段，结合PCR和DNA测序等分子生物学技术来定性或定量检测目标生物，从而确定其分布状况等。科学家采用该技术对某海域进行了物种信息普查研究，确认了该海域出现的布氏鲸的身份信息及相关海域的鱼类组成。下列叙述错误的是（       ）

A．该技术只能用来调查目标区域的生物种类组成，不能用于评估生物数量的多少

B．该技术可针对可能存在的入侵物种设计引物，进行PCR和测序，实现早期监测

C．利用该技术监测目标物种，需了解该物种特有的基因序列

D．相比于传统方法，该技术不会对环境和生物群落造成破坏性影响

9 . 科学家首次运用基因工程的手段，导入优质纤维高产基因 KCS，可提高我国棉花 的产量和品质。经过十多年艰苦实验、不断培育，将我国棉花纤维的长度提高了 0．3 厘米， 如今新疆棉花品质位居世界前列。如图 1 表示含有目的基因 KCS 的 DNA 片段长度(bp 即碱基对)和部分碱基序列，图 2 表 示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有 MspI、BamHI、MboI、SmaI 4 种限制性内切核酸 酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为 C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。据图 回答下列问题：

Ⅰ（1）培育转基因棉花需要用到的工具有_____________________。
（2）若用限制酶 SmaI 完全切割图中含有目的基因 D 的 DNA 片段，其产物长度分别为___________。
（3）基因工程中使用的目的基因主要是指____________________ 。重组质粒中除目 的基因外，还必须有_____________________。
（4）若将图 2 中质粒和目的基因 D 通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应 选用的限制酶是_______ 。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因 D 不能正 确表达，其最有可能的原因是____________________ 。
（5）导入目的基因的植物细胞，经过植物组织培养技术得到幼苗，该技术利用的原理是______。
Ⅱ 为了提高转基因的成功率，需要通过 PCR 技术扩增目的基因，以获得目的基因的大量拷贝。
（6）在目的基因进行扩增时，加入的引物有 A、B 两种，引物的作用是_____， 若该目的基因扩增 n 代，则其中含有 A、B 引物的 DNA 分子有____个。
（7）PCR 过程中退火(复性)温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。如表为根据模板 设计的两对引物序列,如图为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高的退 火温度:_______________。理由是___________________________________ 。
引物对序列表

引物对 A	P1 AACTGAAATGTAGCTATC P2 TTAAGTCCATTACTCTAC
引物对 B	S1 GTCCGACTAGTGGCTGTG S2 AGCTGGCGTTTAGCCTCG

10 . 四尾栅藻生长周期短、适应性强，是一种高潜力生物柴油新型原料，但油脂产量低。研究人员从含油量高的紫苏中提取DGAT1（催化油脂合成的关键酶）基因，并成功导入到四尾栅藻细胞内，获得转基因的产油四尾栅藻。其制备流程如下图，图中Amp^r表示氨苄青霉素抗性基因，LacZ基因可使细菌利用培养基中的物质X-gal进而使菌落呈现蓝色，无该基因或该基因被破坏，菌落呈白色。回答下列问题：

（1）从油量高的紫苏组织细胞中提取总的RNA，经逆转录获得cDNA，用于PCR扩增。该过程获得cDNA的原理是_________________。
（2）PCR扩增DGAT1基因时，需在反应体系中添加2种引物，引物是指__________。
（3）构建的pMD19—DGAT1导入到经CaC1₂溶液处理的感受态大肠杆菌细胞中，并通过稀释涂布平板法接种到含__________的培养基中培养。一段时间后，挑选_______色的菌落以提取质粒pMD19—DGAT1。
（4）用限制酶BamH I和Xba I切割pMD19—DGAT1和pBI 121，将其连接成重组表达载体pBI121—DGAT1，并将其导入四尾栅藻细胞中。与单酶切相比，双酶切的优点是_______________________________________。