2 . A蛋白是某种激素合成的关键酶。为鉴定该激素合成的部位及生理作用，科研团队利用无缝克隆技术将A蛋白结合蛋白基因（P基因）与葡萄糖苷酸酶基因（GUS基因）融合，构建A蛋白检测探针，通过农杆菌转化法导入拟南芥进行实验。相关原理、过程及质粒的结构如下图所示。

注：①bar为抗草甘膦（一种除草剂）基因；Tet^r为四环素抗性基因；Amp^r为氨苄青霉素抗性基因②F₁、F₂、R₁、R₂为引物③BamH I、Sma I、Bcl I为限制酶
(1)无缝克隆时所需的酶除T5核酸外切酶外还有__________。用无缝克隆技术构建GUS-P融合基因的关键是R₂引物5'端序列与_________互补。
(2)利用双酶切法将融合基因插入Ti质粒，选用的限制酶为__________。扩增融合基因所需的引物R₁和F₂应选用下列引物组合为________。
①5'-…CTTGGATGAT-3'②5'-…TAAGTTGTCT-3'③5'-…ATTCAACAGA-3'       ④5'-…TCTGTTGAAT-3'
(3)利用农杆菌转化法将融合基因导入农杆菌、拟南芥细胞的过程中，需要筛选两次，这两次筛选分别是_________。
(4)葡萄糖苷酸酶可以水解X-Gluc呈蓝色，将转基因拟南芥置于不同培养液中培养一段时间，然后分离不同部位的组织分别加入X-Gluc进行鉴定，结果如下表所示：

部位	根	茎	叶
完全培养液	蓝色	浅蓝	浅蓝
缺磷培养液	深蓝	蓝色	浅蓝

分析表明，该激素最主要的合成部位是__________，通过实验结果分析该激素的生理作用是_________。

3 . 目的基因和载体如果用同一种限制酶处理，连接时会出现正反接的情况，为鉴定筛选出的表达载体中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR后，结合电泳技术鉴定，图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，其中目的基因为长度300bp的片段。下列有关说法错误的是（       ）

   

A．PCR复性温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链

B．电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小、带电量和构象有关

C．选取引物甲、丙，扩增出450bp长度片段时，可以说明目的基因正接

D．选取引物甲、乙，扩增出400bp长度片段时，可以说明目的基因反接

4 . “凤凰虫”是一种重要的药用昆虫，其H基因编码的抗菌肽HI-3具有良好的抗菌、抗癌作用。科研人员开展了利用酵母菌生产抗菌肽HI-3的一系列研究。
(1)利用PCR技术从“凤凰虫”基因组中扩增H基因时发现，引物长度越短，扩增得到的DNA片段种类越________（填“单一”或“复杂”），原因是________。
(2)已知H基因编码链序列：5'- GGATCCTCTAGA∙∙∙∙∙∙TCGAGATGCTGCTG -3'，PCR扩增H基因时，结合到编码链上的引物序列是________（要求：按照5'→3'方向写出5'端的前8个碱基）。
(3)由于抗菌肽HI-3会损伤酵母细胞，组成型表达（持续表达）H基因的酵母菌最大种群数量偏低，限制了最终产量。科研人员通过构建诱导型启动子来降低抗菌肽HI-3对酵母菌的伤害。在酵母菌基因组DNA中插入P基因（指导合成P蛋白）和S基因（指导合成S蛋白），使质粒上H基因的表达受红光控制。红光调控H基因表达的原理如下图所示。

由图可知，S蛋白与启动子Jub结合后会抑制________发挥作用，导致H基因无法转录；红光下，P蛋白能够________，解除S蛋白的抑制作用，从而启动H基因的表达。
(4)发酵后菌体和产物分离是发酵工艺的基本环节。定位于细胞表面的F蛋白可使酵母细胞彼此结合，进而沉淀在发酵罐底部。科研人员引入蓝光激活系统，在酵母菌基因组中插入了两个均能合成E蛋白的基因（E1、E2），使F基因的表达受到蓝光控制，如下图所示。

图中E2基因持续性表达少量的E蛋白时，酵母细胞具有接受蓝光刺激的能力；蓝光照射后，F基因的表达被激活，原因是________。

5 . 稻米胚乳直链淀粉含量高会导致食用品质差。研究发现，水稻蜡质基因（Wx）编码直链淀粉合成酶。若Wx基因中第226位碱基是正常的G，该位点所在内含子能被正常剪接，胚乳中直链淀粉含量最高，基因型记做GG；若该位点突变成T，则不能被正常剪接，胚乳中直链淀粉合成水平会降低，基因型记做TT。为检测Wx基因该位点碱基是G或T，研究人员以待测水稻叶片总DNA为材料，以Wx基因片段设计引物如图所示，对PCR扩增产物经AccⅠ酶切后电泳。已知引物1为5'-GCTTCACTTCTCTGCTTGTG-3'，两引物之间无另外的AccⅠ酶的识别位点。下列说法正确的是（       ）

A．该实验中需设计的引物2为5'-TTCAACTCTCGTTAAATCAT-3'

B．若酶切产物只能观察到450bp的DNA条带，则表明该水稻品种为TT型

C．GT杂合型水稻品种酶切电泳结果为3条条带

D．组成上述两种淀粉合成酶的氨基酸种类不同，数目相同

6 . 常规PCR只能扩增两引物间的DNA区段，要扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列，可用反向PCR技术。反向PCR技术扩增的原理如图所示。下列叙述正确的是（       ）

   

A．酶切阶段，L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列

B．环化阶段，可选E．coliDNA连接酶而不能选T4DNA连接酶

C．应选择引物2和引物3进行PCR，且二者不能互补配对

D．PCR扩增，每轮循环前应加入限制酶将环状DNA切割成线状

7 . 反向PCR是利用已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程如下图。下列叙述错误的是（       ）

A．过程①可用同种限制酶切割磷酸和脱氧核糖之间的磷酸二酯键

B．过程②需用DNA连接酶将酶切片段环化以实现对未知序列的扩增

C．过程③需添加方向相对的引物1和3以便DNA聚合酶从其3′端延伸子链

D．过程③中将温度调至72℃的目的是使引物与模板链通过碱基互补配对结合

8 . 科学家将海鱼的抗冻蛋白基因用PCR技术扩增,如图1是扩增的目的基因的示意图。为寻找合适的载体,科学家对某载体用EcoRI和SmaI两种限制酶进行酶切后,再利用琼脂糖凝胶电泳得到图2所示图谱(其中1号泳道是标准DNA样品的电泳结果，2号、3号、4号泳道分别是用EcoRI单独处理SmaI单独处理、两种酶共同处理后的电泳结果)。下列说法错误的是（       ）

A．应选用引物2和引物3对目的基因进行扩增

B．由图2可知该载体DNA分子中两种限制酶的酶切位点各有一个

C．DNA分子经过染色可在紫外灯下观察得到图2所示图谱

D．扩增5次后可得到16个等长的目的基因片段

10 . CRISPR-Cas12a系统是第二类用于编辑哺乳动物基因组的CRISPR-Cas系统，该系统主要包含crRNA和Cas12a蛋白两部分，crRNA能特异性识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas12a蛋白到相应位置剪切DNA。某科研团队基于CRISPR-Cas12a系统对宫颈癌细胞中的KIFC1基因进行敲除，来探讨KIFCI基因在宫颈癌细胞中的功能及对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。
(1)在CRISPR-Cas12a系统中，crRNA的序列与目的基因特定碱基序列部分结合，结合区域最多含__________种核苷酸；细菌细胞中的__________也能起到类似Cas12a蛋白的作用。若要将KIFCI基因从目标DNA上剪切下来，需要设计__________种crRNA。
(2)为保证目的基因与PX458质粒正确连接，在扩增目的基因时，应在引物端加入相应的限制酶序列，其中P1的碱基序列为5′__________3′（写出前9个碱基）。采用PCR技术对一个DNA进行扩增时，第n次循环共需要引物__________个。
(3)在目的基因与PX458质粒连接时，可用__________（填“E.coliDNA连接酶”或“T₄DNA连接酶”）进行连接。
(4)将crRNA-Cas12a重组载体成功转染至HeLa细胞，与对照组相比，实验组中KIFCl蛋白表达量如图2所示，细胞数目的变化如图3所示，由此可得出的结论是__________，判断依据是__________。